食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。全世界每年约有20万人死于食管癌。

人食管癌细胞KYSE150是一种低分化的鳞癌细胞，呈上皮样。将LUC基因稳定整合到LUC染色体上，获得单克隆细胞株，具有很强的发光能力，传代数次后仍能稳定高水平表达LUC。细胞形态和未转染细胞无明显区别。 图1 荧光素酶标记的KYSE150细胞系的阳性克隆检测      模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄6周，体重16—20 g。 BALB／cA-nu裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的DsRed标记的KYSE150-LUC细胞肿瘤细胞，稀释至5×106cells／mL。取200μL细胞悬液进行尾静脉注射接种。

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。结直肠癌癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠，近年有向近端（右半结肠）发展的趋势。其发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切。

人结直肠癌细胞（HCT116）是1979年M.Brattain等从患结肠癌的男性病人中分离的三株恶性结直肠癌细胞系之一，形成上皮样的肿瘤，转染稳定高表达DsRed的细胞，在荧光显微镜下呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。细胞形态和未转染细胞无明显区别。   图1红色荧光标记的HCT-8细胞系 模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的DsRed标记的HCT116肿瘤细胞，稀释至5×106cells／mL。取200μL细胞悬液进行皮下接种。

结肠腺癌是结肠腺上皮来源的常见消化道恶性肿瘤，属于结肠癌多种病理类型中的一种。结肠腺癌起病隐匿，早期仅见粪便隐血阳性，逐步为血便、痢疾样脓血便，里急后重。病人常有不同程度的腹痛，常有糜烂、坏死和继发性感染，左侧结肠癌常并发肠梗阻，时有腹部绞痛，伴有腹胀、肠鸣音亢进等。腹部肿块多见于右腹部，是右侧结肠癌的表现之一，提示已到中晚期，肿块表面可有结节感 ，一般可以推动，但到肿瘤晚期时则固定，合并感染时可有压痛。结肠癌的患者可出现进行性贫血，低热，进行性消瘦，恶液质，肝肿大、浮肿、结肠腺癌黄疸和腹水等。

转染获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养。经过多次传代表达水平稳定，标记细胞的形态、生长方式、生长速度及致瘤能力等与未转染细胞无明显差异。 图1.绿色荧光标记的HCT-8细胞系 模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，BALB／cA-nu裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的细胞，稀释至5×106cells／mL。取200μL细胞悬液进行皮下接种。

人结肠腺癌细胞HCT一8绿色荧光标记肿瘤模型的建立.李小颖，高 凯，刘学丽，张连峰，中国比较医学杂志 2009年7月第19卷第7期

结核病是由结核分枝杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。 排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感（latent TB infection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病发机率。 肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型): 肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

3.1动物的选择     3周岁以上的健康中国产恒河猴作为实验的研究对象。由于恒河猴在自然条件下也存在一定比例的结核分枝杆菌的感染，为此对进入实验的恒河猴需要进行体检。最主要的一项是进行OT测试。旧结核菌素试验采取猴外眼睑皮内注射的方式，注射0.1mL旧结核菌素。猴麻醉后，在猴的右上眼睑皮内注射旧结核菌素（Colorado Serum Company生产的Tuberculin Mammalian, Human Isolates Intrademic）0.1mL，注射后24h，48h，72h观察实验猴的旧结核菌素反应。 实验前3只恒河猴未出现红肿反应，旧结核菌素反应阴性。 3.2动物的饲养和运输 经OT和X光检测结核阴性的动物可以进入ABSL-3实验室。动物麻醉后正常途径进入。进入负压猴笼饲养。常规猴粮，高压灭菌水，每日饲以半个苹果。温度和湿度以及光照条件为常规ABSL-3实验室条件。 感染后猴子的运输采用专用猴运输箱，操作参考感染猴运送SOP。 3.3结核分枝杆菌的准备 结核分枝杆菌的复苏 从ATCC购买的Erdman菌株（ATCC35810）或结核耐药株（内部编号94789），自-80℃冰箱取出，融化，用7H9液体培养基稀释，分装。取稀释后的Erdman菌液接种L-J培养基斜面，100μL/支，37℃培养3周，菌落长至合适大小。在斜面上加3-4mL 7H9培养基，将菌落自斜面上轻轻刮下，转移至研磨器中，研磨均匀，将研磨好的菌液适当稀释，分装，去一管转接到L-J斜面生长用于菌落计数，其余菌放-80℃冰箱保存备用。 3.4恒河猴的麻醉和复苏 在进行纤支镜和X光检测时由于操作时间较长，需要使用长效麻药复方氯胺酮麻醉动物，用生理盐水1：5稀释麻药，稀释液按照每公斤体重0.1ml的标准肌肉注射麻药，麻醉动物。实验结束后肌肉注射苏醒剂苏醒3号。具体操作参考SOP。 3.5纤维支气管镜的感染操作 动物平放于手术车上，固定四肢。长时间操作需要给动物吸氧。按照纤维支气管镜仪器操作规则，在麻醉动物的齿间放入咬合器，通过咬合器从舌与上腭间插入支气管镜，注意观察监视器，找到声门裂，小心插入支气管镜，进入气管后通过纤支镜给药通道注入2ml利多卡因（注射用）。 继续向下，转入右侧肺至下叶位置。插入感染用纤支镜喷洒导管，感染剂量100CFU。使用5mL注射器推入2mL菌液，之后再推入3mL空气，排尽注射导管内的残余菌液。将纤支镜连同注射管一同取出，进行清洗。清洗程序注射管推入5mL生理盐水，再推入消毒酒精5ml，推入清水5ml，推入生理盐水5ml。取出注射管，纤支镜用生理盐水清洗。 检测感染结核分枝杆菌数量，感染用菌液经L-J斜面培养计数。 3.6动物静脉取血 麻醉动物剪去肘部猴毛，暴露皮肤。酒精面擦拭皮肤表面消毒。5ml注射器静脉采血，取抗凝血和自凝血。分别分离细胞和血清，进行下列血沉、CRP、细胞因子、流式细胞学抗结核抗体等实验。血清分离后冻存于低温冰箱。 3.7动物体温测定 体温芯片的植入：准备好芯片扫描仪,检查是否有电，给体温芯片编号，将芯片录入。麻醉动物后，选择后颈部或上臂近后肩处，酒精棉消毒后，提起皮肤，在皮下植入体温芯片，检查芯片固定的位置，是否脱出，消毒进针口。用芯片扫描一下检验是否正常。 3.8动物的胸部X光检查 检查的头一天晚上实验猴禁水食，检查当天对动物进行麻醉，用数字X光机检查肺部。使用的参数如下： 选择狗的模式，设置参数 高度：64cm，厚度：12cm电压：50kv 电流：1.8~2.4mA之间, 根据猴的大小，固定电压值，调电流。 3.9 CT 检查的头一天晚上实验猴禁水食，检查当天对动物进行麻醉，用数字X光机检查肺部。 在人用的CT机器上选择幼儿参数模式，调节电压和电流使图像分辨率达到要求，如电压为120kv,电流为350mA。设置参数建立三维图, 图像存储为dicom格式，用软件计算病变的体积。 3.10 CRP检测 取全血2ml于血清管中，4℃ 3000rpm离心20min分离血清。血清中C-反应蛋白测定按照MONKEY C-REACTIVE PROTEIN(CRP) ELISA TEST KIT说明书进行操作，结果以ng/ml表示。具体步骤为：按要求重悬标准品后，依次稀释成75ng/ml，37.5 ng/ml，18.75 ng/ml，9.38 ng/ml，4.69 ng/ml，2.34 ng/ml，1.17 ng/ml和0 ng/ml。将各浓度的标准品和1:1000稀释后的动物血清分别加至已包被抗体的96孔板中，100ul/孔。室温孵育45min，洗板后每孔加HRP标记的检测抗体100ul。室温孵育45min后，洗板，加TMB 100ul/孔进行显色。室温避光显色20min后加终止液，于450nm处读取OD值。根据标准曲线计算每只动物感染后不同时间点时血清中的C-反应蛋白含量。 3.11血沉检测 恒河猴麻醉后，取全血1.6ml于柠檬酸钠抗凝的血沉管中，颠倒混匀5—8次，垂直插在血沉架上，将血沉管血液的液面与血沉架上的0刻度线对齐，室温静置1h后观察红细胞下降的mm数。 3.12血清中结核抗体（IgG）的检测     按照结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒（胶体金法）使用说明书进行操作：将试剂和反应板取出平衡至室温，反应板上依次标号。在每个反应孔中加2滴封闭液，待吸收完全后分别加入分离的血清各40ul，之后每孔加入洗涤液各6滴，待吸收完全后每孔加2滴金标液进行显色。最后每孔加入6滴洗涤液，待吸收完全后目测结果。结果的判定以质控点和反应孔中间同时出现红色斑点为阳性，若质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹者为阴性。

结核病是由结核分枝杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。 排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感（latent TB infection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病发机率。 肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型): 肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

3.1实验用小鼠的选择： 选择年龄6~8周龄，体重16~20g， SPF级雌性C57BL/6和BALB/c小鼠（提供厂商:中国医学科学院实验动物研究所）。动物使用申请号:中国医学科学院实验动物研究所实验动物管理委员会（批准号：MC—09-2003）。 3.2饲养环境： 动物生物安全3级实验室（ABSL-3）；温湿度范围：18-28℃；相对湿度：40-70％；换气次数：机械送排风；明暗周期：12h/12h；照度：150-300Lux；清洁消毒：用具、笼架等在投入使用前进行消毒；笼具种类及饲育密度：小鼠笼，12只一笼； 3.3饲养条件 中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司小鼠专用饲料,自由采食；垫料为中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司，定期更换；饮水；普通自来水经过高压(121℃,30min)，自由饮用。 3.4实验用小鼠的分组及感染 实验共分为三个大组，第一组为C57BL/6尾静脉注射组、第二组为C57BL/6腹腔注射组和第三组为BALB/c尾静脉注射组，其中每一个大组中分四个小组：正常对照组(生理盐水)、高剂量组（1X106CFU）、中剂量组（1X105 CFU）和低剂量组（1X104 CFU），每组12只小鼠，共144只小鼠。 3.5感染用菌株 用结核分枝杆菌标准菌株H37Rv株或结核耐药株（内部编号94789）。 3.6观察 小鼠在进入ABSL-3实验室之后,观察4~5天后,进行感染实验。感染后，观察每天感染小鼠的临床症状，并每周称取小鼠体重，观察不同感染方式和不同感染剂量小鼠体重的变化规律。 3.7病理检查和组织荷菌量计数 分别在感染后6周、8周和10周，每组解剖3只小鼠，分别无菌取小鼠1/2脾脏、1/2肺脏，无菌研磨后接种L-J斜面进行结核分枝杆菌的分离培养。并将同一组织的剩余部分固定在10%福尔马林中，进行病理切片。

结核病是由结核分枝杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。 排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感（latent TB infection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病发机率。 肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型): 肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

3.1实验用豚鼠的选择： 选择体重:300~350g SPF级，雌性Hartley豚鼠（提供厂商：北京维通利华实验动物技术有限公司）。动物使用申请号:中国医学科学院实验动物研究所实验动物管理委员会（批准号：MC—09-2003）。 3.2饲养环境 —动物生物安全3级实验室（ABSL-3）；温湿度范围：18-28℃；相对湿度：40-70％；换气次数：机械送排风；明暗周期：12h/12h；照度：150-300Lux；清洁消毒：用具、笼架等在投入使用前进行消毒；笼具种类及饲育密度：豚鼠笼，3只一笼； 3.3饲养条件 饲料:中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司豚鼠专用饲料,自由采食；垫料为中国医学科学院实验动物研究所华阜康有限公司，定期更换；饮水；普通自来水经过高压(121℃,30min)，自由饮用。 3.4观察 豚鼠在进入ABSL-3实验室之后，进行检疫，PPD阴性者，观察4~5天后，进行感染实验. 3.5实验用豚鼠的分组及感染： 实验共分为四个大组，第一组为正常对照组(生理盐水)、第二组为高剂量组（1X104 CFU）、第三组为中剂量组（1X103 CFU）和第四组低剂量组（1X102 CFU）。每组36只均，共144只（5只备用，实际为150只），均采用后肢蹊部皮下注射。 3.6感染用菌株 结核分枝杆菌标准菌株Dt株（ATCC 35810）和结核菌耐药株（内部编号94789） 3.7实验观察 感染后，每天观察感染豚鼠的临床症状，每周称取豚鼠体重，观察不同感染剂量豚鼠体重和脏器指数的变化规律。 3.8解剖后病理和荷菌量检测 分别在感染后1d、2d、3d、5周和6周，每组解剖6只豚鼠，分别无菌活体心脏取血，并在解剖后1/2脾脏、1/2肺脏和1个腹股沟淋巴结，无菌研磨后接种L-J斜面进行结核分枝杆菌的分离培养。并将同一组织的剩余部分固定在10%福尔马林中，进行病理切片。

　　结直肠癌又称大肠癌, 是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。 早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则出现贫血、体重减轻等全身症状。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60%。全球每年新发大肠癌病人高达93万，在我国每年新发病例高达13-16万人，在消化道肿瘤中大肠癌的发病率仅次于胃癌；在我国目前大肠癌患病率已经高达46.8/10万；大肠癌已经成为中国三大癌症之一，在我国大肠癌发病年龄以40－60岁之间居多，平均发病年龄为48.3岁，男女之比为2：1。

　　将对数生长期的HCT-116-LUC细胞接种于2只BALB/CA-nu爪垫，接种细胞数量为1×106/只, 分别在第7,14,28d观察一次，观察前每只裸鼠腹腔注射荧光素底物（1.5mg/10g）,饱和三溴乙醇（0.18ml/10g）麻醉后放入活体荧光影响系统摄像，Slide Book 4.0软件进行分析。模型制作采用的BALB／CA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

结直肠癌又称大肠癌, 是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。 早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则出现贫血、体重减轻等全身症状。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60%。全球每年新发大肠癌病人高达93万，在我国每年新发病例高达13-16万人，在消化道肿瘤中大肠癌的发病率仅次于胃癌；在我国目前大肠癌患病率已经高达46.8/10万；大肠癌已经成为中国三大癌症之一，在我国大肠癌发病年龄以40－60岁之间居多，平均发病年龄为48.3岁，男女之比为2：1。

　　将对数生长期的HCT-116-eGFP细胞皮下接种于2只BALB/CA-nu，接种细胞数量为1×106/只, 采用活体荧光影像系统摄像动态观察。模型制作采用的BALB／CA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

　　类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以滑膜持续炎症和关节软骨及骨破坏为特征的慢性进行性的自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。RA在我国的发病率为0. 26%~0. 5%，能够发生于任何年龄，女性发病多于男性[1]。RA炎症反应造成患者机体肉芽组织和纤维增生，使得关节腔内的血供严重受损；严重的缺血使得局部出现坏死，以累及周围关节为主，故其基本病理改变为滑膜炎[2]。主要临床表现为关节肿痛，继而软骨破坏、关节间隙变窄，晚期因严重骨质破坏、吸收导致关节僵直、畸形、功能障碍。 　　该疾病为一种反复发作性疾病，致残率较高，预后不良，目前还没有很好的根治方法。

　　使用8~9周龄的C57BL/6J雌性小鼠，分为两组，每组各6~7只。 　　关节炎诱导试剂为Chondrex公司生产的Arthrogen-CIA®Arthritogenic Monoclonal Antibody试剂盒。 对于模型组小鼠，每只腹腔注射5mg胶原抗体混合物，记为第0天，第3天时腹腔注射25~50μg LPS，能够快速诱导发病；第10~11天可选择性地再次注射25~50μg LPS，使加重病情，延长发病周期，继续观察。对照组在同样的时间腹腔注射等体积的PBS。

[1]张群，王竞秋. 类风湿性关节炎发病机制与临床治疗的研究进展[J]. 内蒙古中医药，2013，27：148-149. [2]杨超，刘荣臻，张晓延，等. 类风湿性关节炎患者血清中IL-37水平变化的探索研究[J]. 中华全科医学，2014，12（7）：1035-1037. [3] Zhao P-W, Jiang W-G, Li W，et al. Plasma Levels of IL-37 and Correlation with TNF-a, IL-17A, and Disease Activity during DMARD Treatment of Rheumatoid Arthritis [J]. PLoS ONE, 2014, 9(5): e95346.

人乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染引起的传染病，全球至少有20亿人曾经被乙肝病毒感染。HBV是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，据目前所知，HBV只对人和猩猩有易感性。HBV在肝内繁殖复制，但是对肝细胞无明显的直接损伤作用，但会引发免疫系统攻击感染HBV的肝细胞，形成慢性肝炎，继而发展为肝纤维化，是引发肝癌的重要因素。 目前，由于HBV疫苗的使用，使HBV感染率显著降低，但慢性乙肝存在较大的转为肝癌的风险。由于缺乏理想的乙肝动物模型，限制了针对乙肝病程发展和干预治疗策略的研究进展。 1978年，萨默斯(Summers)等发现费城动物园的土拨鼠感染土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck Hepatitis Virus，WHV）。WHV与HBV在形态学、基因结构、基因产物、复制过程、流行病学及疾病和肝癌的发展上有很高的相似性，WHV可引起急性自限性感染和慢性感染，其发病机理及免疫反应机制和HBV类似。WHV感染成年土拨鼠会导致急性自限性肝炎，而感染新生土拨鼠会发展为慢性肝炎，慢性肝炎易发展为肝细胞癌（HCC），土拨鼠模型的疾病发展特征使其成为研究慢性乙型肝炎向终末期肝病转化的理想动物模型。

1、病毒制备 WHV为cWHV7P1毒株（NCBI存储号:M18752.1），来自美国乔治敦大学微生物与免疫室，采集来自慢性感染土拨鼠的血清，病毒储存液浓度为1×1010 拷贝/ml。 2、动物 7日龄-1月龄土拨鼠。实验前进行血清病毒WHV DNA 的PCR检查，阴性土拨鼠方可入组。 3、感染实验 动物经兽用氯胺酮麻醉后，经颈外静脉注射WHV，感染剂量分别为5×106 WID50（低剂量）和1×107 WID50（高剂量），感染体积为100 μl，病毒储存液用生理盐水稀释，对照组土拨鼠注射等体积的生理盐水，感染后的土拨鼠隔离饲养。在感染后不同时间点，动物经兽用氯胺酮麻醉后，心脏取血，离心分离血清。 4、血清检测 感染后血清标志物检测：土拨鼠肝炎病毒表面抗原（WHsAg）和核心抗原（WHcAg）经过大肠杆菌原核表达系统表达，经镍离子亲和层析纯化。WHsAg分别免疫兔和鸡后获得兔抗WHsAg抗体和鸡抗WHsAg抗体。通过ELISA双抗夹心法检测WHsAg，ELISA直接法检测WHcAb。 5、核酸检测 使用DNA提取试剂盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit从50 μl血清中抽提 WHV DNA。利用实时荧光定量PCR测定血清中WHV DNA拷贝数，引物为WHVSF1\\WHVSR1(5’-GGCAACAACATAAAAGTCAC-3’\\5’-AACTAAACCACGTGGTATGTC-3’)，梯度稀释的WHV DNA质粒做标准品。 6、肝功能检测   取血样检测感染后土拨鼠肝功能酶：丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)。 7、病理诊断 甲醛固定的土拨鼠肝脏组织经石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE染色，显微镜下观察病理改变。 8、免疫组化 肝脏病变组织经过组织修块，石蜡包埋后，切片厚度为4μm，经脱蜡水化，抗原修复，滴加20%正常山羊抗血清室温封闭后，滴加兔抗WHsAg抗体，稀释比例1:500,4度过夜。次日PBS洗涤，滴加荧光标记二抗，稀释比例1:5 000，PBS洗涤后，DAB显色，脱水封片，镜下观察。

1. 一月龄土拨鼠肝炎病毒感染模型的建立. 王亮，肖冲，沈邵伟，王学民，徐艳峰，刘江宁，秦川。《中国病毒学杂志》2014年03期.

　　结核病是由结核分枝杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。 　　排菌的肺结核患者是传染源,人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。大多数的受感染者没有病症，称为潜伏结核感染（latent TB infection），但其中约5-10%的潜伏感染者会发展至活动性结核；若无适当治疗，一个活动病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率则超过50%。若潜伏感染者同时罹患免疫抑制，如爱滋病，每年就有10%的病发机率。 　　肺结核病程较复杂，临床分型有：1、原发型肺结核(Ⅰ型):肺内渗出病变、淋巴管炎和肺门淋巴结肿大的哑铃状改变的原发综合征。儿童多见，仅表现为肺门和纵隔淋巴结肿大。 2、血型播散型肺结核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺结核及亚急性、慢性血型播散型肺结核。 3、继发型肺结核(Ⅲ型):可以出现以增殖为主、浸润为主、干酪病变为主或以空洞为主等多种病理改变。

菌株准备 　　结核分枝杆菌标准株H37Rv或耐药株（内部编号94789）经小鼠体内两次增毒，于罗氏斜面培养基培养，收获斜面培养3周的细菌经5μm无菌滤器( Millipore公司)制成单细胞菌悬液，经罗氏斜面培养基培养计数，单细胞悬液菌浓度为1× 107 CFU /ml，单细胞悬液分装冻存于－80℃低温冰箱备用。 动物的选择 　　中缅树鼩，1年龄，雄性，清洁级，体重100-170g，购自中国科学院昆明动物研究所。实验动物的使用得到了北京协和医学院中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管理委员会的批准（批准号ILAC-PC-2012-003），动物在感染前一周进入医学实验动物研究所生物安全3级实验室。 动物分组与感染 　　取树鼩固定于保定袋中，暴露股静脉，75%酒精擦拭消毒，静脉注射250μl结核分枝杆菌H37Rv单细胞悬液，感染剂量为2.5× 106 CFU（高剂量组），将H37Rv单细胞悬液稀释1000倍，再静脉注射250μl，感染剂量为2.5× 103 CFU（低剂量组），高低剂量组各感染树鼩10只，4只为正常对照组，股静脉注射同等体积的生理盐水，所有实验均在医学实验动物研究所生物安全3级实验室（BSL-3）进行操作。 样本采集 　　攻毒后每天观察树鼩活跃度，用红外线体温计监测树鼩体温，每周称量一次体重。 　　感染后5W高剂量组取4只（其中一只病重死亡，死亡后及时解剖），低剂量组取4只，正常对照组取4只，8W高、低剂量组各取3只，11W高剂量组取3只，低剂量组取3只腹腔注射2%戊巴比妥钠（剂量为40mg/Kg）麻醉后心脏采血处死；1.6ml血液放置血沉管中，轻柔颠倒混匀数次，垂直静置血沉架上30分钟后读取1小时血沉值，约1.5ml血液放置血常规管，轻柔颠倒混匀数次，用动物血细胞分析仪检测血常规； 无菌取各组织，先后经过生理盐水、4%硫酸和生理盐水漂洗，进行组织病理分析、荷菌量检测、蛋白质谱分析和部分差异蛋白转录水平的分析。 组织病理分析 　　将采集后的各组织用4%中性甲醛固定一周后，常规方法切片、HE染色，光学显微镜观察病理组织学变化。 组织荷菌量检测 　　无菌取各组织约50mg，漂洗后加1ml生理盐水用玻璃组织研磨器研磨，组织悬液经无菌生理盐水按照1：10稀释后取0.1ml接种罗氏斜面培养基，平行接种3管。以上2个浓度均置于37℃，5%CO2培养箱中培养4周后进行菌落计数。 组织切片抗酸染色 　　病理组织片按常规方法脱蜡后染色，将脱蜡后的组织切片置于湿盒内，滴上抗酸初染液，90℃水浴5分钟后用细流水倾斜冲洗玻片至初染液洗掉后再滴上复染液脱色复染，直至玻片上的组织呈淡蓝色；镜检。 蛋白质谱分析 　　将高剂量组、低剂量组、正常对照组三组肺组织样品于沸水中5分钟灭活结核分枝杆菌。送公司进行蛋白样品的裂解、浓度测定， 蛋白酶解后用iTRAQ标记各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。基于Triple TOF 5600进行LC-ESI-MS/MS质谱分析。基于NCBI树鼩核酸序列数据库（50461 sequences），利用蛋白质鉴定软件Mascot 2.3.02进行检索，选择已经建好的数据库，进行数据库的搜索，并对质谱质量进行评估。获得的数据进行蛋白质生物信息学分析，包括差异蛋白的筛选，进行GO、COG注释，差异蛋白Gene Ontology富集分析、pathway富集分析，以及多样品间表达模式聚类分析。随机选取部分差异蛋白，用SYBR-Green的荧光定量PCR进行转录水平的分子验证。即从ITRAQ筛选的差异表达基因中选择一部分与结核感染相关的基因进行qRT-PCR验证。

　　手足口病是由肠道病毒引起的，以发热和手、足、手足口病是流行于亚太地区的婴幼儿常见传染病。柯萨奇病毒A16型（CA16）和人肠道病毒71型（EV71）是手足口病的主要病原体之一，引发婴幼儿手足口病及疱疹性咽峡炎，严重并发症包括无菌性脑膜炎，而神经源性的肺水肿或肺出血是导致婴幼儿死亡的原因之一。该病毒近年来在大陆地区的感染，已经造成了数十万儿童感染，并不时伴随有死亡病例，目前尚无临床可以使用的疫苗和治疗药物。 　　CA16属于微小RNA病毒科，肠道病毒属。CA16感染主要引起自限性的手足口病，偶尔引起的神经系统并发症包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经源性肺水肿和心功能衰竭等，严重者可导致死亡。 　　CA16主要通过粪口传播，病毒最初定植于鼻咽部或胃肠道粘膜，侵入淋巴组织并在其中繁殖，进而引起第一次病毒血症。若机体免疫力差，病毒可扩散至全身组织器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血症，最终侵犯靶器官，如脑、脑膜、脊髓、心肌和横纹肌以及皮肤黏膜组织，引起重症病变。尸检时主要病变为神经元坏死等。

1、病毒准备 　　CA16在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、繁殖，采用冻融法释放病毒，超速离心法富集病毒。毒株为shzh05-1，2008年分离自深圳市，GenBank存储号为EU262658。 2、实验动物 　　可使用SPF级别的1-10日龄乳鼠，品系包括ICR、C57BL6J、Balb/c，母鼠自然哺乳，在动物生物安全二级实验室内独立饲养。 3、病毒感染 　　根据预实验确定感染剂量，10日龄乳鼠经轻度麻醉后，经腹腔注射2.5×107 TCID50 的CA16 shzh05-1,攻毒体积为100微升/只，空白对照组注射等量RD细胞上清。 4、模型分析指标 （1）症状观察 感染后动物观察14天，记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准对动物进行打分： 0，未见异常；1，竖毛；2，后肢迟缓无力；3.单后肢瘫痪；4，双后肢瘫痪；5，死亡。 （2）病毒检测 分别在感染后第1天、3天、5天和7天处死动物，分离主要组织器官，提取RNA，采用实时荧光定量PCR法检测组织内病毒载量，记录病毒复制情况。PCR引物序列为：CA16-F1: GAAAAACCCTCGACACACTAG；CA16-R1: ATCAGCGTCCTTGCAATACTCG  (1095) （3）病理诊断 分别在感染后第3天、5天处死动物，分离主要组织器官，HE染色观察病理改变。