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CSTR:16397.09.0C01001457 脓肿分枝杆菌感染SCID小鼠模型 SCID mice models for Mycobacterium Abscessus infection

脓肿分枝杆菌是一种快速生长的非结核分枝杆菌, 是引起非结核分枝杆菌病中最常见的病原菌之一。对患有肺部疾病如慢性阻塞性肺病、囊性纤维化和肺气肿的患者,常造成严重的呼吸道和粘膜感染。据统计,非结核分枝杆菌感染引起的疾病中,肺部脓肿分枝杆菌复合体的感染率为2.6-13.0%,但只有45.6%的患者可以成功治愈,表明目前脓肿分枝杆菌感染的治疗仍缺乏有效的策略。流行病学相关研究也表明,脓肿分枝杆菌常引起医院院内感染,这对医疗系统的卫生健康构成了重大的威胁。目前关于脓肿分枝杆菌感染的动物模型的报道较少,我们通过雾化感染SCID小鼠,建立了脓肿分枝杆菌的感染模型。

1.实验材料 1.1 实验动物 SCID小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 1.2 主要实验仪器 Nikon光学显微镜 BIO-RAD电泳仪 Tanon电泳槽 Tanon数码凝胶图像处理系统 Incucell恒温培养箱温控 TAITEC振荡箱 Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2.实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得首都医科大学附属北京胸科医院实验动物伦理委员会的批准,批准号为XK2023-117,简要步骤如下: 2.1 脓肿分枝杆菌的感染 将SPF级6‐8周龄雌性SCID小鼠(质量16-20g)随机分为5组,每组5只。感染剂量为2×104CFU,感染方式为雾化感染,感染时长28天。 2.2 标本的收集 动物安乐死后摘眼球取血,解剖取肺、脾组织样本。肺组织用剪刀剪碎,加胶原酶在37摄氏度摇床中消化20-30 min。用筛网过滤后加PBS洗一遍,离心后加红细胞裂解液处理5 min,若细胞沉淀仍有红色,可再裂解一次。加PBS重悬细胞,计数。将脾组织倒在筛网上,用注射器的尾部研磨,加PBS冲洗筛网,离心后加红细胞裂解液处理5min,加PBS重悬细胞,计数。 2.3 小鼠肺脏、脾脏内菌落计数 小鼠处死后在无菌的条件下取部分肺脏和脾脏用于组织病理学观察。对剩余的肺脏和脾脏用研磨器研磨后,用无菌的生理盐水分别按照1:10,1:100,1:1000,1:10000,1:100000五个梯度进行稀释,每份稀释液涂布两块7H10平板,涂布完毕后将平板包好装袋,置于37°C培养箱培养3-4周至长处肉眼可见的清晰菌落。观察结果,选择合适的浓度梯度(菌落数在30-300个之间)进行计数。

CSTR:16397.09.0C01001456 BCG疫苗安全性评价及免疫原性评价的动物模型 Animal models for safety and immunogenicity evaluation of BCG vaccines

结核病是全球公共卫生面临的重大挑战之一,根据世界卫生组织(WHO)发布的《2023年全球结核病报告》,结核病是仅次于COVID-19的第二大致死性传染病。在30个结核病高负担国家中我国估算结核病发病数排第3位。全球结核病发病率下降趋势发生逆转,防治形势十分严峻。而与此同时,耐药结核病日趋严重。 控制这一全球流行病的最有效手段是预防性免疫,因此疫苗的研发急不可待。目前唯一获得批准使用的结核疫苗还是100年前发明的卡介苗BCG,但是卡介苗保护效果差强人意,对成年人保护效果弱。因此,为实现WHO提出的“终结结核病流行”目标,研发新型结核疫苗至关重要。 人类感染结核是一个复杂的过程,所有候选疫苗进入临床试验前必须评价其安全性、免疫原性以及有效性。候选结核疫苗的评价模型常使用的动物包括小鼠、豚鼠以及非人类灵长类动物等。然而疫苗效果的评估具有复杂性和不确定性,随着开发新的、更有效的结核病疫苗工作的开展,改进疫苗评估的临床前动物模型的建立具有十分重要的意义。

1. 实验材料 1.1 实验动物 SCID和C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司 1.2 主要实验仪器 BIO-RAD电泳仪 Thermo Fisher Scientific 紫外-可见分光光度计 Innova44 恒温摇床 BD LSRFortssa 流式细胞仪 Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得首都医科大学附属北京胸科医院实验动物伦理委员会的批准,批准号为XK2023-117,简要步骤如下: 2.1 BCG候选疫苗免疫接种 将SPF级6‐8周龄雌性SCID小鼠(质量16‐20 g)随机分为5组,每组5只。免疫剂量为1×106/1×107 CFU,免疫方式为尾静脉接种,免疫周期为1针,总时长42天。 将SPF级6‐8周龄雌性C57BL/6小鼠(质量16‐20 g)随机分为5组,每组5只。免疫剂量为1×106 CFU,免疫方式为皮下免疫,免疫周期为1针,总时长60天。 2.2 标本的收集 动物安乐死后摘眼球取血,解剖取肺、脾组织样本。肺组织用剪刀剪碎,加胶原酶在37摄氏度摇床中消化20-30 min。用筛网过滤后加PBS洗一遍,离心后加红细胞裂解液处理5 min,若细胞沉淀仍有红色,可再裂解一次。加PBS重悬细胞,计数。将脾组织倒在筛网上,用注射器的尾部研磨,加PBS冲洗筛网,离心后加红细胞裂解液处理5 min,加PBS重悬细胞,计数。 2.3小鼠肺脏、脾脏内菌落计数 小鼠处死后在无菌的条件下取部分肺脏和脾脏用于组织病理学观察。对剩余的肺脏和脾脏用研磨器研磨后,用无菌的生理盐水分别按照1:10,1:100,1:1000,1:10000,1:100000五个梯度进行稀释,每份稀释液涂布两块7H10平板,涂布完毕后将平板包好装袋,置于37°C培养箱培养3-4周至长处肉眼可见的清晰菌落。观察结果,选择合适的浓度梯度(菌落数在30-300个之间)进行计数。 2.4 流式细胞分析 用不同的荧光抗体标记细胞,通过流式细胞仪分析细胞的亚型分群。肺取10^6,脾取10^7个细胞,离心后用100ul PBS重悬。准备流式管,包括每个样品管和一个空白管,每个抗体的单染管和一个调电压的管。空白管,单染管和调电压的管加100ul 其中一个样本脾的细胞,其他按样品各加100ul。空白管不加抗体,单染管加5ul相应单个抗体,调电压的管和所有样品管加5ul所有抗体的混合液,4℃孵育30min,离心, 加1ml PBS重悬后离心洗一次,加2%的多聚甲醛固定后加到流式管中,上机检测。 2.5 血清细胞因子检测 样品从-80℃取出放冰上融化。按照Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay试剂盒protocol操作。

CSTR:16397.09.0B01001455 肠道病毒EV71腹腔注射感染PTX31基因敲除小鼠模型 Enterovirus EV71 intraperitoneally infected PTX31 knockout mouse model

手足口病( hand, foot and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病,主要传播途径是粪口传播,多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的,轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹,多数患儿一周左右自愈;但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快,可导致死亡。手足口病在我国2008年开始暴发流行,当年累计病例489540例,死亡127例;其后发病病例呈逐年上升趋势, 2014年至2016年累计7302354例病例。在人群方面,手足口病高发于5岁以下婴幼儿,其中以1~3岁发病率最高,各个年龄段罹患率、重症率、死亡率男性均高于女性,人口密度越大发病率越高。在时间方面,手足口病爆发存在明显季节性特征,尽管全年均有手足口病感染情况,但主要高发于夏季, 4~6月达发病高峰。地区差别、气温、相对湿度、降水、日照时数、气压等气象因素也在该病的传播中起重要作用。自2008年5月2日,手足口病已被我国列为丙类传染病,该病流行已成为严重的公共卫生问题,为我国带来了巨大的经济和健康负担。 引发手足口病的肠道病毒有20多种(型),主要由肠道病毒(enterovirus)、柯萨奇病毒(coxsakievirus)和埃可病毒(echovirus)组成。这些病原均属于小RNA病毒科肠道病毒属(Enterovirus genus),基本结构为无包膜的二十面体,其直径为20-30nm,由核酸和蛋白质组成,是单股正链RNA病毒。病毒基因组含有两个非编码区和一个开放阅读框,开放阅读框编码多聚蛋白;其中VP1基因序列具有高度多样性,且较为稳定,因此可作为肠道病毒属血清型分型依据和评价疫苗效价的生物标志物。手足口病毒主要通过粪口途径传播,经胃肠道进入机体内。 EV71作为手足口病的主要病原,于1969年首次在加利福尼亚神经异常的病人体内分离并鉴定。最近几十年,EV71感染引起的手足口病疫情在世界范围内大爆发,主要集中于亚太地区。我国自2008年开始发生手足口病流行以来,EV71一直是主要的流行病原,且该病毒感染伴随严重的并发症几率相对较高,包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性弛缓性麻痹和心力衰竭;因此一直是手足口病研究的重点。 PTX3是体液性天然免疫系统的一种可溶性模式识别受体,被称为“抗体前体”,可识别外源微生物,作为调理素调节炎症反应。PTX3由吞噬细胞产生,由中性粒细胞储存,经刺激后产生释放可与部分抗原结合,被巨噬细胞或中性粒细胞相应受体识别,从而增强其吞噬活性,促进机体天然免疫。PTX3对外界感染导致的免疫系统产生的炎症反应具有调控作用:一方面PTX3通过调节补体功能来进行相关调节,它可以识别多种补体成分,从而激活补体系统,同时它也对补体激活又具有负调控作用。另一方面,PTX3还通过调控炎性细胞的募集来参与炎症反应;该效应由PTX3与粘附分子P-选择素(P-selectin)的相互作用来介导,二者结合可减少炎症部位对中性粒细胞募集,抑制白细胞滚动进而抑制炎性细胞浸润。PTX3在病毒性感染引发的炎症中起着重要的作用。

1.实验材料 1.1 实验动物 PTX3基因敲除小鼠(PTX3-/- C57BL/6N)购于百奥赛图基因生物技术有限公司,通过PCR鉴定基因敲除小鼠是否为纯合子;基因敲除小鼠在医学实验动物研究所屏障设施动物房中繁殖饲养。SPF级10日龄野生型C57BL/6N小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。感染用动物由母鼠自然哺乳,在ABSL-2实验室独立饲养。 1.2 主要实验仪器 Olympus光学显微镜 Thermo二氧化碳培养箱 Sigma低温高速离心机 海尔-20℃冰箱 SANYO -80℃超低温冰箱 ABI QuantStudioTM 3荧光定量PCR仪 哈东联生物安全柜(型号:HDL) 高压灭菌锅(TOMY SX-700) Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为LJN21002,简要步骤如下: 2.1 PTX3基因敲除小鼠的鉴定: 采用的检测引物为: Primer Sequence (5’-3’) Ptx3-WT-F GCGCTAGCACTTCAGGTTACAGCAA Ptx3-WT-R AGCTTGCTTCATTGGCTATCTATGTT Ptx3-Mut-F GCGCTAGCACTTCAGGTTACAGCAA Ptx3-Mut-R AAGCTTTGTGTGGCAATGTCGAGAG 2.2 病毒准备: EV71病毒为FY0805毒株经小鼠传代所获得的适应株MP10(GenBank accession number:HQ712020)。组织病毒培养操作: 将EV71病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠,三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀,3000rpm离心30min,上清即为病毒液,分装后置于-80℃冰箱保存。 2.3 病毒感染: 根据预实验确定的感染剂量,即病毒滴度为105 TCID50/mL的EV71病毒,将病毒经腹腔注射感染小鼠,感染剂量为100μl。感染小鼠包括:野生型C57BL/6N小鼠、纯合子PTX3-/- C57BL/6N小鼠。

CSTR:16397.09.0B01001454 肠道病毒EV71腹腔注射感染STAT1基因敲除小鼠模型 Enterovirus EV71 intraperitoneally infected STAT1 knockout mouse model

手足口病( hand, foot and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病,主要传播途径是粪口传播,多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的,轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹,多数患儿一周左右自愈;但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快,可导致死亡。手足口病于1957年在新西兰被发现并以其临床症状而命名,在世界范围内均有流行。在我国2008年开始暴发流行,当年累计病例489540例,死亡127例;其后发病病例呈逐年上升趋势, 2014年至2016年累计7302354例病例。在人群方面,手足口病高发于5岁以下婴幼儿,其中以1~3岁发病率最高,各个年龄段罹患率、重症率、死亡率男性均高于女性,人口密度越大发病率越高。在时间方面,手足口病爆发存在明显季节性特征,尽管全年均有手足口病感染情况,但主要高发于夏季, 4~6月达发病高峰。在地区方面,中国南方一年中存在五月和十月两个发病高峰;而在北方仅有六月一个发病高峰,随着纬度的增加,其半年周期性可能会增强。与此同时,气温、相对湿度、降水、日照时数、气压等气象因素也在该病的传播中起重要作用。自2008年5月2日,手足口病已被我国列为丙类传染病,该病流行已成为严重的公共卫生问题,为我国带来了巨大的经济和健康负担。 引发手足口病的肠道病毒有20多种(型),主要由肠道病毒(enterovirus)、柯萨奇病毒(coxsakievirus)和埃可病毒(echovirus)组成。这些病原均属于小RNA病毒科肠道病毒属(Enterovirus genus),基本结构为无包膜的二十面体,其直径为20-30nm,由核酸和蛋白质组成,是单股正链RNA病毒。病毒基因组含有两个非编码区和一个开放阅读框,开放阅读框编码多聚蛋白;其中VP1基因序列具有高度多样性,且较为稳定,因此可作为肠道病毒属血清型分型依据和评价疫苗效价的生物标志物。手足口病毒主要通过粪口途径传播,经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖,然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合,完成吸附过程,其基因组RNA进入胞质。之后,病毒以其正链RNA作为模板,合成互补的负链RNA,又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA,从而得到大量病毒RNA,进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译,复制出二代病毒,再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。 EV71作为手足口病的主要病原,于1969年首次在加利福尼亚神经异常的病人体内分离并鉴定。最近几十年,EV71感染引起的手足口病疫情在世界范围内大爆发,主要集中于亚太地区。我国自2008年开始发生手足口病流行以来,EV71一直是主要的流行病原,且该病毒感染伴随严重的并发症几率相对较高,包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性弛缓性麻痹和心力衰竭;因此一直是手足口病研究的重点。STAT1是机体免疫系统实现抗病毒、减少组织损伤的的媒介之一,在许多抗病毒感染进程中扮演重要角色。STAT1介导的JAK/STAT 信号通路在EV71病毒感染过程中可以发挥抗病毒的作用,同时EV71病毒也可以影响STAT1信号通路的激活。

1. 实验材料 1.1 实验动物 STAT1基因敲除小鼠(STAT-/- C57BL/6)由医学实验动物研究所遗传中心研制,通过PCR鉴定基因敲除小鼠是否为纯合子;基因敲除小鼠在医学实验动物研究所SPF级动物房中繁殖饲养。SPF级10日龄野生型C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。感染用动物由母鼠自然哺乳,在ABSL-2实验室独立饲养。 1.2 主要实验仪器 Olympus光学显微镜 Thermo二氧化碳培养箱 Sigma低温高速离心机 海尔-20℃冰箱 SANYO -80℃超低温冰箱 ABI QuantStudioTM 3荧光定量PCR仪 哈东联生物安全柜(型号:HDL) 高压灭菌锅(TOMY SX-700) Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为LJN21002,简要步骤如下: 2.1 STAT1基因敲除小鼠的鉴定: 采用的检测引物为: STAT1-KO-S 5’ GAGAGTAATTTAATGGTTGGGCTC        TM= 63 STAT1-KO-A 5’ CATGTGAGTCCTGTATCCCTCTAATAGTAAC TM=62 鉴定结果如下(图1): 图1. STAT1基因敲除小鼠纯合子和杂合子鉴定电泳图 2.2 病毒准备: EV71病毒为FY0805毒株经小鼠传代所获得的适应株MP10(GenBank accession number:HQ712020)。组织病毒培养操作: 将EV71病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠,三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀,3000rpm离心30min,上清即为病毒液,分装后置于-80℃冰箱保存。 2.3 病毒感染: 根据预实验确定的感染剂量,即病毒滴度为105 TCID50/mL的EV71病毒,将病毒经腹腔注射感染小鼠,感染剂量为100μl。感染小鼠包括:野生型C57BL/6小鼠、纯合子STAT-/- C57BL/6小鼠和杂合子STAT+/- C57BL/6小鼠。

CSTR:16397.09.0B01001453 手足口病柯萨奇病毒A16型灌胃感染小鼠模型 Coxsackievirus A16 intragastrically infected mice model

手足口病( hand, foot and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病,主要传播途径是粪口传播,多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的,轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹,多数患儿一周左右自愈;但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快,可导致死亡。手足口病于1957年在新西兰被发现并以其临床症状而命名,在世界范围内均有流行。在我国2008年开始暴发流行,当年累计病例489540例,死亡127例;其后发病病例呈逐年上升趋势, 2014年至2016年累计7302354例病例。在人群方面,手足口病高发于5岁以下婴幼儿,其中以1~3岁发病率最高,各个年龄段罹患率、重症率、死亡率男性均高于女性,人口密度越大发病率越高。在时间方面,手足口病爆发存在明显季节性特征,尽管全年均有手足口病感染情况,但主要高发于夏季, 4~6月为发病高峰。在地区方面,中国南方一年中存在五月和十月两个发病高峰;而在北方仅有六月一个发病高峰,随着纬度的增加,其半年周期性可能会增强。与此同时,气温、相对湿度、降水、日照时数、气压等气象因素也在该病的传播中起重要作用。自2008年5月2日,手足口病已被我国列为丙类传染病,该病流行已成为严重的公共卫生问题,为我国带来了巨大的经济和健康负担。 引发手足口病的肠道病毒有20多种(型),主要由肠道病毒(enterovirus)、柯萨奇病毒(coxsakievirus)和埃可病毒(echovirus)组成。这些病原均属于小RNA病毒科肠道病毒属(Enterovirus genus),基本结构为无包膜的二十面体,其直径为20-30nm,由核酸和蛋白质组成,是单股正链RNA病毒。病毒基因组含有两个非编码区和一个开放阅读框,开放阅读框编码多聚蛋白;其中VP1基因序列具有高度多样性,且较为稳定,因此可作为肠道病毒属血清型分型依据和评价疫苗效价的生物标志物。手足口病毒主要通过粪口途径传播,经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖,然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合,完成吸附过程,其基因组RNA进入胞质。之后,病毒以其正链RNA作为模板,合成互补的负链RNA,又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA,从而得到大量病毒RNA,进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译,复制出二代病毒,再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。 由于CA16病毒主要通过粪口传播,在自然感染状态下经胃肠道侵入机体,因此通过灌胃感染途径得到的动物模型更接近于疾病自然发生的状态。课题组在原有CA16小鼠腹腔注射感染模型的基础上,继续研究了通过灌胃方式建立的小鼠感染模型,为研究病毒的感染机制和机体免疫反应提供研究基础,也可用于药物和疫苗开发和验证实验。

1. 实验材料 1.1 实验动物 SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司,由母鼠自然哺乳,在ABSL-2实验室独立饲养。 1.2 主要实验仪器 Olympus光学显微镜 Thermo二氧化碳培养箱 Sigma低温高速离心机 海尔-20℃冰箱 SANYO -80℃超低温冰箱 ABI QuantStudioTM 3荧光定量PCR仪 哈东联生物安全柜(型号:HDL) 高压灭菌锅(TOMY SX-700) Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为LJN20013,简要步骤如下: 2.1 病毒准备: CA16病毒(shzh05-1,GenBank: EU262658),2008年分离自深圳市,在人横纹肌瘤细胞(RD)中培养、扩增,并采用反复冻融法释放病毒,离心富集病毒。 2.1.1 细胞病毒培养操作: RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶,培养至融合度约80%;感染前弃去原培养基,细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍,吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA16病毒后,置于37℃ 5% CO2培养箱孵育1~2h;之后弃去无血清培养基,加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++~++++,将T75细胞瓶置封口袋中,-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中,4℃ 2000rpm离心20min,沉淀细胞碎片。吸取病毒上清,分装后冻存,并测定病毒滴度TCID50。 2.1.2 组织病毒培养操作: 将CA16病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠,三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀,3000rpm离心30min,上清即为病毒液,分装后置于-80℃冰箱保存。 2.2 病毒感染: 根据预实验确定的感染剂量,即病毒滴度为108 TCID50/mL的CA16毒株,将病毒经灌胃途径感染小鼠,感染剂量为100μl。对照组灌胃同等量的PBS。

CSTR:16397.09.0B01001452 手足口病柯萨奇病毒A6型腹腔注射感染小鼠模型 Coxsackievirus A6 intraperitoneally infected mice model

手足口病是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病,多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。自1998年以来,已经成为世界范围内的重大公共卫生问题。手足口病一般为自限性的,轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹,多数患儿一周左右自愈;但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快,可导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型),主要由肠道病毒(enterovirus)、柯萨奇病毒(coxsakievirus)和埃可病毒(echovirus)组成。 手足口病毒主要通过粪口途径传播,经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖,然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合,完成吸附过程,其基因组RNA进入胞质。之后,病毒以其正链RNA作为模板,合成互补的负链RNA,又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA,从而得到大量病毒RNA,进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译,复制出二代病毒,再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。此外,大部分肠道病毒在感染宿主机体时,主要由口腔进入消化道,在肠淋巴组织和感染者的咽部快速繁殖,随淋巴循环进入血液循环,之后侵入到肝、骨髓等处进行大量增殖并再次通过血循环,到达心脏、肺、肝脏等处,大量繁殖造成组织器官病变。 自2008年在芬兰的爆发以柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus A6, CA6)为主要病原的手足口病开始,CA6在世界范围的流行变得更为活跃,且出现了相应的重症病例。在法国、西班牙、美国、日本、泰国等国家都相继报道了CA6的手足口病流行事件,逐渐受到各国重视。2013年以前,中国多地区暴发流行的手足口病病原以EV71和CVA16为主,2013 年以后CA6 和CA10 相关的手足口病的比例逐渐上升,成为国内手足口病感染的优势病原体。在上海、西安、宁波、北京、吉林等地,2012-2013年的手足口病例中CA6所占比例已超过EV71和CA16,成为这些地区的主要致病原。在2017年,广东省爆发了CA6感染导致的大规模的手足口病流行,其中CA6的感染比例高达85.5%。类似的流行趋势也出现在中国其他地区,并呈现增长趋势。 与EV71和CA16相比,CA6引起的手足口病临床特征主要为发热、非典型性疱症和脱甲症。有研究表明,由CA6感染引起的HFMD患者中,脱甲症出现的几率高于EV71和CA16感染。手足口病通常发生在夏季和秋季,但由CA6引起的疾病有着冬季多发的特征。除手足口病之外,感染CA6还通常导致疱症性咽峡炎(HA),这种疾病会表现出口部出现疼痛性水疱的症状。CA6病毒具有五个分支(A-E),并具有两个亚系(E1、E2)。在2011年前,亚洲和欧洲地区D系、E1系和E2系毒株共存。自2008年以来,E2亚型已逐渐成为主要毒株,并导致全球手足口病爆发。

1.实验材料 1.1 实验动物 SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司,由母鼠自然哺乳,在ABSL-2实验室独立饲养。 1.2 主要实验仪器 Olympus光学显微镜 Thermo二氧化碳培养箱 Sigma低温高速离心机 海尔-20℃冰箱 SANYO -80℃超低温冰箱 ABI QuantStudioTM 3荧光定量PCR仪 哈东联生物安全柜(型号:HDL) 高压灭菌锅(TOMY SX-700) Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为LJN22008,简要步骤如下: 2.1 病毒准备: CA6病毒(购自ATCC,Gdula毒株,GenBank:AY421764.1),病毒在人横纹肌瘤细胞(RD)中培养、扩增,并采用反复冻融法释放病毒,离心富集病毒。 2.1.1 细胞病毒培养操作: RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶,培养至融合度约80%;感染前弃去原培养基,细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍,吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA6病毒后,置于37℃ 5% CO2培养箱孵育1~2h;之后弃去无血清培养基,加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++~++++,将T75细胞瓶置封口袋中,-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中,4℃ 2000rpm离心20min,沉淀细胞碎片。吸取病毒上清,分装后冻存,并测定病毒滴度TCID50。 2.1.2 组织病毒培养操作: 将CA6病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠,三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀,3000rpm离心30min,上清即为病毒液,分装后置于-80℃冰箱保存。 2.2 病毒感染: 根据预实验确定的感染剂量,即病毒滴度为2X105 TCID50/mL的CA6病毒,将病毒经腹腔注射(i.p.)感染小鼠,感染剂量为100μl。对照组注射同等量的PBS。

CSTR:16397.09.0G01001451 造血干细胞人源化小鼠模型 humanized-hematopoietic stem cells  mice model

人源化小鼠是指具有人类基因、细胞或组织的小鼠模型。免疫系统人源化小鼠是将人细胞或免疫器官移植至严重免疫缺陷小鼠体内,使小鼠体内具有人的免疫系统,免疫系统人源化的小鼠不具有遗传性的。目前移植方式构建人源化小鼠模型:(1) Hu-PBL-SCID 模型是将成年人的外周淋巴细胞静脉注射到免疫缺陷小鼠体内。(2) Hu-SRC-SCID 模型是将造血干细胞(来自胎儿肝脏、脐带血或者骨髓) 注射到新生的免疫缺陷小鼠体内。(3)SCID-Hu 模型是将人的胎儿肝与胎儿胸腺一起移植入免疫缺陷小鼠肾被膜下。(4) BLT 模型是将人的胚胎肝脏和胸腺联合共同移植到免疫缺陷鼠肾的被膜下。 本模型我们利用人脐血来源的CD34+细胞,移植入免疫缺陷小鼠NPG中,构建人源化免疫缺陷小鼠。为人类传染病研究、基因治疗和细胞治疗研究、肿瘤免疫研究、抗体药物研究提供动物模型。

1. 实验材料 1.1 实验动物 NPG小鼠购自北京维通达生物技术有限公司。 1.2 主要实验仪器 AriaII流式细胞仪 生物安全柜 涡旋混合仪 移液器 Rad Source RS2000系列生物学X-ray辐照仪 隔离器 2.实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为BL18003。涉及人的生物医学伦理研究,批准号为BL23001。简要步骤如下: 2.1 纯化CD34造血干细胞 2.1.1 使用Miltenyi Biotec的CD34 MicroBead试剂盒纯化脐血来源的CD34造血干细胞。 2.1.2 用RPMI重悬细胞,放在冰上备用。 2.2 移植小鼠 2.2.1 使用X-ray辐照仪对NPG小鼠使用0.6 Gy的剂量进行全身照射。 2.2.2 从EP管中吸取1-2只量于注射器中,每只200ul,不宜吸入过多,以免细胞沉淀堵住注射器针口。 2.2.3 将小鼠固定于小鼠固定器中,尾巴通过固定器末端伸出,在距离鼠尾尖1/4至1/3处血管,持注射器向尾根部呈30°进针。 2.2.4 针头刺入确认有回血后,将细胞溶液匀速注入,注射后立即拔针用棉球止血。 2.3 检测人源化小鼠 2.3.1 移植后1月后进行检测,尾静脉抗凝采血。 2.3.2 将采集的血样进行裂红,加入ACK溶液裂红每管1ml,静待5分钟。 2.3.3 1500rpm离心5分钟,弃掉上清液 2.3.4 每个样本10μl加入流式抗体染色,4度30分钟。 2.3.5 加入1000μlPBST溶液离心,1500rpm离心5分钟。 2.3.6 上机测试样本。 2.3.7 数据分析,用人和小鼠的CD45检测,人CD45比例代表人源化比例。

Yue H, Bai L: Progress, implications, and challenges in using humanized immune system mice in CAR-T therapy-Application evaluation and improvement. Animal models and experimental medicine 2023

CSTR:16397.09.0B01001450 肠上皮NSD2条件性敲除小鼠结直肠癌模型 NSD2 flox/flox, Vil1-Cre Mouse Model

结直肠癌是一种常见的异质性肿瘤,在所有恶性肿瘤中发病率位居第四,死亡率位居第二。结直肠癌的早期症状不明显,患者随着肿瘤的逐渐增大而表现出排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状;晚期则表现出贫血、体重减轻等全身症状。当前,结直肠癌对许多患者来说仍然是致命的,深入了解结直肠癌发生发展的病理机制对于该疾病的早期诊断和治疗至关重要。

1.小鼠的构建 NSD2-floxp(NSD2fl/fl)小鼠与Vil1-Cre小鼠由北京唯尚立德生物科技有限公司构建完成。根据NSD2基因组结构和蛋白功能保守区,NSD2存在多种转录产物,其中exon3为公共的外显子,位于蛋白保守功能区Msh6_like上,编码167 bp碱基数。因此条件性删除exon3后,可能会破坏蛋白保守功能区Msh6_like,使mRNA重新剪切形成新的mRNA,发生移码突变,导致蛋白失活。因此选取exon3两边插入floxP位点,实现将exon3条件性敲除,达到条件性敲除目标基因的目的。 利用CRISPR技术剪切目标基因内含子的DNA,同时提供同源模板Donor, 通过DNA的同源重组修复在特定外显子两端插入floxp。NSD2fl/fl小鼠与组织特异性表达Cre的Vil1-Cre小鼠交配,使得NSD2特定外显子被删除,NSD2将不翻译或者发生移码突变,引起蛋白失活,从而实现肠上皮细胞条件性敲除NSD2的目的。 图1 NSD2fl/fl-Vil1-Cre小鼠的构建 2.结直肠癌模型的构建 实验第1天,每只小鼠按12 mg/kg腹腔注射溶于生理盐水的结肠嗜器官致癌物偶氮甲烷(azoxymethane,AOM;A5486, Sigma),化学诱导小鼠结直肠癌。正常饲养小鼠5天后,将2.5%的右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS;9011-18-1, Merck) 溶解在动物饮用水中,连续5天诱导小鼠结肠炎。随后,提供两周的正常饮水。接下来,重复进行两轮2.5% DSS诱导(第25-29天和第44-48天)。最后,在第90天对终止实验,处死小鼠进行样本分析。

Mengyuan Li,Hanxue Chen,Xingjiu Yang,Wenlong Zhang,Chengyan MA,Qinghong WANG,Xinpei WANG,Ran Gao . Conditional Knockout of NSD2 Gene in Mouse Intestinal Epithelial Cells Inhibit Colorectal Cancer Progression. Animal Models and Experimental Medicine. 2024,1,16 已接收

CSTR:16397.09.0C01001449 过表达hACE2转基因高血压合并新冠肺炎小鼠模型 SARS-COV-2 infection hypertensive hACE2 transgenic mice model

新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019, COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 , SARS-CoV-2)感染导致的以肺炎为特征的新发传染病。自2019年底以来,全球范围内感染新冠肺炎的人数还在逐日递增,新冠肺炎疫情的出现给世界公共医疗卫生系统带来了巨大的负担与冲击,严重影响了人们的生活,威胁着人类的健康。 有研究发现,在这些死亡病例中未报告合并症患者的猝死率约为0.9%,有合并症患者死亡率则高得多,其中心血管疾病患者为10.5%,糖尿病为7.3%,慢性呼吸道疾病为6.3%。临床数据显示,合并高血压或患有其他心血管疾病的人群,更易被新冠病毒感染。此类患者急需动物模型进行药物评价。

1.实验材料 1.1实验动物 hACE2 转基因小鼠来自中国医学科学院医学实验动物研究所 1.2主要实验仪器 Nikon显微注射仪 Nikon光学显微镜 BIO-RAD电泳仪 Tanon电泳槽 Tanon数码凝胶图像处理系统 Incucell恒温培养箱温控 TAITEC振荡箱 Eppendorf离心机 Eppendorf移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为MYW22004,简要步骤如下: 2.1  ANGII诱导高血压 选取转人hACE2转基因小鼠,在体灌注血管紧张素II(AngII) 400ng/kg.min以及生理盐水(0.9% NaCl),28天诱导hACE2转基因小鼠高血压升高,同时伴有靶器官损伤。 2.2构建SARS-COV-2病毒感染高血压小鼠模型 利用医科院医学实验动物研究所SARS-COV-2感染平台,传代分离并扩增冠状病毒 SARS-COV-2,通过滴鼻(105 TCID50)对hACE2转基因高血压小鼠进行 SARS-COV-2病毒感染,从而构建高血压合并新冠肺炎小鼠模型。

Jiang xiaoliang; Li Huadong; Liu Yong; Bao Linlin; Zhan Linjun; Gao Hong; Deng Wei; Xue J ing; Liu Jiangning; Liu Xing; Li Junli; Wang Jie; Wu Shuang; Yan Mingzhe; Luo Wei; Pedro A Jose; Qin Chuan; Yang Xiuhong; Zhang Dingyu; Yang Zhiwei ; The Effects of ATIR Blocker on the Severity of COVID-19 in Hypertensive Inpatients and Virulence of SARS-CoV-2 in Hypertensive hACE2 Transgenic Mice, J Cardiovasc Transl Res, 2022, 1(11): 1-11

CSTR:16397.09.0H02001446 Trim44神经元特异敲除大鼠模型 SD.Trim44(tm-NeuN-cre)-GC/ILAS

神经退行性疾病 ( Neurodegenerative disease)是一组涉及大脑和脊髓的神经元退行性变性、丢失的疾病总称。主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等。其中AD是导致老年人学习记忆衰退甚至完全丢失的一种痴呆症,危害极大。2021中国AD报告,我国AD患者已近千万,而且该数字仍在逐年攀升。然而,AD因发病机制复杂,至今尚未完全了解,更是缺乏有效的治疗手段。除了聚焦APP、Tau等致病基因突变导致神经元丢失和记忆障碍的研究外,近些年基于全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies,GWAS)揭示的AD风险基因以及在大脑中高表达的其他基因已成为AD研究的热点,旨在为AD防治寻找新的靶点。

在本实验中,我们利用Trim44flox/flox大鼠和NeuN-Cre大鼠进行杂交,繁育得到Trim44flox/flox-NeuN-Cre大鼠。Trim44flox/flox大鼠是在Trim44基因第1外显子的两端插入flox序列,因此当与NeuN-Cre大鼠杂交后,神经元中的Cre酶会特异性剪切Trim44基因的第1外显子,导致Trim44基因的特异性敲除。

张丽,马元武,张旭,等. Trim44 敲除导致老年大鼠神经元凋亡和学习记忆能力下降 [J]. 中国比较医学杂志, 2023, 33(3): 1-8.

CSTR:16397.09.0L02001100 C1ql3基因敲入大鼠模型 Wistar.ROSA26(tm-CAG-C1ql3)-GC/ILAS

痴呆症(dementia)患者在过去 10 年间从 2400 万增加到 4700 万,预测至2050 年全球痴呆患者将达到 1 亿 3 千万。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是痴呆症中最常见的类型。在 65 岁以上的老年人群中 AD 患病率达到5.56%,预测到 2050 年我国 AD 患者将达 3000 万。 AD 主要的病理特征包括由淀粉样蛋白(amyloid-beta, Aβ)沉积导致的胞外老年斑(senile plaques, SPs)聚集、胞内神经纤维缠结(intracellular neurofibrillary tangle)、胶质细胞应答(glia responses)、神经元丢失(neuronal loss)和突触丢失(synaptic loss)等。小胶质细胞在Aβ清除和AD病理发展进程中扮演重要角色。

利用CRISPR/cas9介导的大鼠基因敲入技术,将CAG启动子驱动的C1QL3 cDNA敲入到ROSA26位点,建立定点转基因大鼠(KI)。

CSTR:16397.09.0L02001101 C1ql3基因敲除大鼠模型 Wistar.C1ql3(tm)- GC/ILAS

痴呆症(dementia)患者在过去 10 年间从 2400 万增加到 4700 万,预测至2050 年全球痴呆患者将达到 1 亿 3 千万。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是痴呆症中最常见的类型。在 65 岁以上的老年人群中 AD 患病率达到5.56%,预测到 2050 年我国 AD 患者将达 3000 万。 AD 主要的病理特征包括由淀粉样蛋白(amyloid-beta, Aβ)沉积导致的胞外老年斑(senile plaques, SPs)聚集、胞内神经纤维缠结(intracellular neurofibrillary tangle)、胶质细胞应答(glia responses)、神经元丢失(neuronal loss)和突触丢失(synaptic loss)等。小胶质细胞在Aβ清除和AD病理发展进程中扮演重要角色。

利用CRISPR/Cas9技术建立C1ql3敲除大鼠。靶向C1ql3第一外显子设计两个sgRNAs,序列分别为TCATCCTCATCCCGGTGCTGG和AAGGTGCTGACAAGAGGGAGG。Cas9 蛋白 (30 ng/μL) 和两个sgRNAs (10 ng/μL)显微注射进入受精卵的胞浆,移植进入假孕母鼠。出生的小仔进行基因型鉴定。

C1ql3 knockout affects microglia activation, neuronal integrity, and spontaneous behavior in Wistar rats(Animal Models and Experimental Medicine, 2024,accept)