扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy, DCM）

扩增并经测序比对正确的CYP2E1片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达CYP2E1表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型，Western Blot分析CYP2E1蛋白的表达情况（图1）。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准(GC08-2027)。   图1. CYP2E1转基因小鼠的建立及鉴定 CYP2E1表达载体构建图(A)及Western Blot分析CYP2E1蛋白的表达情况(B).

1.Zhang W, Lu D, Dong W, Zhang L, Zhang X, Quan X, Ma C, Lian H, Zhang L. Exprssion of CYP2E1 increases oxidative stress and induces apoptosis of cardiomyocytes in transgenic mice. FEBS J. 2011 Feb 25. 2.张伟，李小颖，张连峰.小鼠CYP2E1基因靶向miRNA表达载体的构建及鉴定[J]. 中国比较医学杂志，2009, 19(6):9-12.

QT间期延长综合症（long QT syndrome，LQTS）

扩增并经测序比对正确的KCNQ1V180L突变片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达KCNQ1V180L表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型，Western Blot分析KCNQ1V180L突变蛋白的表达情况（图1）。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准（ILAS-GC-2012-001）。 图1. KCNQlV180L转基因小鼠的建立 (A) 将靶基因KCNQlV180L插入心脏特异表达的α-MHC启动子下游，构建KCNQlV180L转基因表达载体；(B) PCR鉴定KCNQlV180L转基因小鼠基因型，M: DNA分子量标记；1：阳性对照；2：阴性对照；3：空白对照；6，8：阳性转基因小鼠；4，5，7：阴性转基因小鼠；(C) Western Blot分析KCNQl蛋白在转基因小鼠心脏组织中的表达。

1.吕丹, 鲍丹, 董伟, 陈炜, 张旭, 曹兴水, 张连峰. 心脏特异性表达KCNQ1V180L转基因小鼠的建立及表型分析[J]．中国比较医学杂志, 2012, 22(11): 16-22.

扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy, DCM）

扩增并经测序比对正确的LMNAE82K突变片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达LMNAE82K表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型，Western Blot分析LMNAE82K突变蛋白的表达情况（图1）。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准(GC05004)。   图1. LMNAE82K转基因小鼠模型的建立及鉴定 将LMNAE82K突变基因片段插入α-MHC心脏组织特异性启动子下游构建转基因表达载体(A), PCR法鉴定小鼠基因型(B), M: 分子量标记; 1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 空白对照;  5,6: LMNAE82K阳性转基因小鼠; 4,7: 阴性转基因小鼠. Western Blot分析LMNAE82K突变蛋白表达(C). WT: 同龄阴性对照小鼠; F030: 首建鼠30号; F035: 首建鼠35; GAPDH: 内参.

1.吕丹, 陈炜, 冯娟, 张伟, 王书美, 张丽, 曹兴水, 秦川, 张连峰．心脏特异表达LMNAE82K转基因小鼠的建立[J]．中国比较医学杂志，2009, 19 (10): 16-19． 2.Dan Lu, Hong Lian, Xiaojuan Zhang, Haitao Shao, Lan Huang, Chuan Qin, Lianfeng Zhang. LMNA E82K Mutation Activates FAS and Mitochondrial Pathways of Apoptosis in Heart Tissue Specific Transgenic Mice. PLoS ONE. 2010 Dec 6; 5(12): e15167.

1）小鼠经麻醉备皮，固定于手术操作板上； 2）小鼠经口气管插管连至呼吸机（频率为125-150次/分钟）； 上起咽部，切口开至第二肋间隙行开胸手术； 分离胸腺及主动脉外包绕脂肪，于无名动脉（innominate artery (IA)，即头臂动脉干(brachiocephalic trunk)）和左颈总动脉（left common carotid artery, LCCA）间主动脉弓下备线并打活结备用，拉活结将27G平针头和主动脉系紧，此时即获得理论直径约为0.4mm的无名动脉远端主动脉弓重建血管。 缝合胸骨及皮肤，待小鼠恢复自主呼吸后撤气管插管； 6）小鼠置于鼠笼内恢复俯卧位，注意保暖，如呈现脱水现象可腹腔注射生理盐水。

1） 吕丹，鲍丹，董伟，廉虹，路迎冬，张旭，张连峰. 主动脉缩窄术模型小鼠成模早期评价技术[J]．中国实验动物学报. 2013, 21(4): 21-25. 2） Bao D, Lu D, Liu N, Dong W, Lu YD, Qin C, Zhang LF. Tomoregulin-1 inhibits cardiac hypertrophy after pressure overload via TAK1-JNK pathways in mice. Dis Model Mech. 2015 Jun 18. pii: dmm.021303. [Epub ahead of print]

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS） 是由遗传、环境等多因素导致的老年多发性疾病，近年来有逐渐年轻化和上升趋势。随着社会的发展和生活水平的提高，感染性疾病所导致的死亡不断减少，而动脉粥样硬化疾病导致的死亡迅速增多，目前已成为全球人口死亡的首位原因。 动脉粥样硬化的发病机理学说甚多，如脂质浸润学说、血栓源学说、血液动力学学说、中层平滑肌细胞增生学说、内膜损伤学说及受体学说等，现逐渐明确动脉粥样硬化的发病机理是复杂的，是综合性的较长过程。动脉壁内皮损伤是动脉粥样硬化的始动因素。动脉壁内皮细胞有调节血管张力、血管通透性、抗血栓形成及分泌多种活性物质等重要生理功能。当内皮细胞受某些因素如：高血压、高胆固醇血症、血液中血管紧张素Ⅱ、肾上腺素、去甲肾上腺素、缓激肽的增高，血氧饱和度降低等的刺激均可使血管内皮损伤。受损伤的内皮细胞发生功能改变和渗透性增高，血液中的单核细胞粘附在内皮细胞损伤处进入内皮下，吞噬脂质成为泡沫细胞，形成脂肪斑。血小板聚集并粘附于内皮的损伤处。吞噬细胞、内皮细胞及粘附于内皮细胞损伤处的血小板释放生长因子刺激平滑肌细胞进入内膜并增殖，脂肪斑变成纤维斑块，损伤的内皮细胞通透性改变，血浆中的低密度和极低密度脂蛋白更多地进入内膜，导致动脉粥样硬化。总之，动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病。 动脉粥样硬化的症状主要决定于血管病变及受累器官的缺血程度，主动脉粥样硬化常无症状，冠状动脉粥样硬化者，若管径狭窄达75%以上,则可发生心绞痛、心肌梗塞、心律失常，甚至猝死。脑动脉硬化可引起脑缺血、脑萎缩，或造成脑血管破裂出血，肾动脉粥样硬化常引起夜尿、顽固性高血压、严重者可有肾功能不全。肠系膜动脉粥样硬化可表现为饱餐后腹痛便血等症状。下肢动脉粥样硬化引起血管腔严重狭窄者可出现间歇性跛行、足背动脉搏动消失，严重者甚至可发生坏疽 [6][8]。

1. 高脂饲料的配方：胆固醇1%、猪油5%、蛋黄粉5%、猪胆盐0.2%和兔基础饲料88.8%。 2. 适应期：适应期动物喂食普通饲料，适应4天。 3. 过渡期：动物每天喂食喂普通与高脂的混合饲料（1:1混合）150g约1周。 4. 造模期：每天喂高脂饲料，每只动物每天喂饲量均为150g，连续喂食11周。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起的糖、蛋白质、脂肪和水电解质等代谢紊乱所导致的疾病，能够导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。随着人民饮食结构、生活方式等等的改变，全球糖尿病发病率的逐年增高，对糖尿病的研究越来越多，因此创建合适的DM动物模型进行病因学、病理机制、药物作用靶点、药效学研究对糖尿病的治疗及预防等有着重要意义。目前使用的糖尿病模型的建立方法较多，包括：胰腺切除、化学药物（如链脲佐菌素、四氧嘧啶等）特异性破坏胰岛β细胞、胰腺切除联合化学药物特异性破坏、病毒诱导（如柯萨奇病毒）、自发性动物模型（如KK小鼠）以及转基因糖尿病模型（如IRS-1、IRS-2基因敲除小鼠等）。链脲佐菌素STZ与四氧嘧啶(ALx)相比，同为诱导DM动物模型的常用化学造模方法，但STZ更具有用药量小、药物毒性低、胰岛β细胞损害特异性高等优点，而且STZ致DM作用几乎不受饲料成分和营养状态的影响。链脲菌素(streptozotocin，STZ)诱导糖尿病ICR小鼠动物模型，是目前糖尿病动物实验研究中应用最多的方法之一。

1. 柠檬酸缓冲液的配制：精密称量柠檬酸（FW:210.14）2.1g，加入100mL双蒸水中溶解配成A液。精密称量柠檬酸钠（FW:294.10）2.94g，加入100mL双蒸水中溶解配成B液。使用时将A、B液按一定比例混合（1：1），测定PH值，调节PH至4.2~4.5，即得所需的柠檬酸缓冲液。 2. 链脲佐菌素（STZ）配制液：动物注射时用柠檬酸缓冲液溶解并配制成为1%浓度的STZ溶液。注意：STZ容易失活，STZ快速称取后要求干燥避光，推荐用干燥铝箔（或锡箔）纸。动物给药在30分钟内注射完毕。 3. 动物模型制作：按照70mg/kg体重（7ml/kg体重）腹腔注射1%的STZ溶液，注射后第4天开始，每天测定随机血糖1次，连续3次随机血糖高于14.1mmol/L的动物，禁食4h后测定空腹血糖，血糖高于11.1mmol/L认为造模成功。如未达到该要求，可根据情况酌情增加一次STZ注射（按照100mg/kg体重的1% STZ溶液腹腔注射给予ICR小鼠）。

结肠腺癌是结肠腺上皮来源的常见消化道恶性肿瘤，属于结肠癌多种病理类型中的一种。

制作稳定高表达DsRed的细胞，在荧光显微镜下呈强荧光，并且荧光均匀分布于整个细胞内，传代数次后仍能稳定高水平表达DsRed（图1）。细胞形态和未转染细胞无明显区别。 图1红色荧光标记的CACO-2肿瘤细胞 模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄6周，体重16—20 g。 BALB／cA-nu裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的CACO-2-DsRed肿瘤细胞，稀释至5×106cells／mL。取200μL细胞悬液进行皮下注射接种。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，胃癌可发生于任何年龄，每年约17万人死于胃癌。

人低分化前胃癌细胞BGC823建自一位62岁的胃癌患者，将LUC基因稳定整合到LUC染色体上，获得单克隆细胞株，具有很强的发光能力，传代数次后仍能稳定高水平表达LUC，细胞形态和未转染细胞无明显区别。 图1 荧光素酶标记的BGC823细胞系的阳性克隆检测 BALB／cA-nu裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的转染细胞，稀释至2×106cells／mL。取250μL细胞悬液接种于已禁食24h的裸鼠胃壁浆膜下，并可见浆膜下鼓起一透亮小泡为标志。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，胃癌可发生于任何年龄，每年约17万人死于胃癌。

制作稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下呈强荧光，并且荧光均匀分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP（图1）。细胞形态和未转染细胞无明显区别。 图1绿色荧光标记的BGC823细胞系 模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄6周，体重16—20 g。BALB／cA-nu裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的MGC803-eGFP肿瘤细胞，稀释至5×106cells／mL。取200μL细胞悬液进行皮下注射接种。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，胃癌可发生于任何年龄，每年约17万人死于胃癌。

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下呈强荧光，并且荧光均匀分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP，细胞形态和未转染细胞无明显区别。 模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄6周，体重16—20 g。BALB／cA-nu裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的MGC803-eGFP肿瘤细胞，稀释至5×106cells／mL。取200μL细胞悬液进行皮下注射接种。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，胃癌可发生于任何年龄，每年约17万人死于胃癌。

稳定高表达Luc的单克隆细胞株获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆(图1箭头所示)，经过多次传代表达水平稳定，标记细胞的形态、生长方式、生长速度等与未转染细胞无明显差异。 图1荧光素酶标记的MGC803细胞系,箭头所指为MGC803-Luc+阳性克隆株 模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重14—18 g。  BALB／cA-nu裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的转染细胞，稀释至2×106cells／mL。取250μL细胞悬液接种于已禁食24h的裸鼠胃壁浆膜下，并可见浆膜下鼓起一透亮小泡为标志。

荧光素酶标记人胃癌细胞裸鼠原位移植模型的建立.李小颖，董伟，张连峰。中国比较医学杂志，2011年第21卷第四期

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。全世界每年约有20万人死于食管癌

获得稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下呈强荧光，并且荧光均匀分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP，细胞形态和未转染细胞无明显区别。 模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄6周，体重16—20 g。BALB／cA-nu裸小鼠在实验室无特定病原体饲养间饲养。收集处于生长对数期的DsRed标记的KYSE150-GFP细胞肿瘤细胞，稀释至5×106cells／mL。取200μL细胞悬液进行皮下接种。