2019冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）引起，以重症肺炎、呼吸衰竭为特征的传染性疾病。SARS-CoV-2病毒传染性强，自2019年12月在中国武汉出现后，快速在全球传播，引发全球大流行。截至2020年11月17日，SARS-CoV-2累计确诊感染人数超5542万，现有确诊人数超过1580万人，因COVID-19死亡达133万人。我国累计报告确诊病例92482例，死亡4749例。新型冠状病毒的传播严重影响了人们的正常生活，已成为全球关注的公共卫生和社会热点问题，新型冠状病毒肺炎的防控与治疗也是目前研究的热点。

1.实验材料：SARS-CoV-2病毒；选用体重4-6 kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，所有感染动物必须在ABSL-3实验室中进行。 2.气管途径SARS-CoV-2再感染恒河猴模型制作方法：每只动物经气管途径给予1毫升体积，106 TCID50 SARS-CoV-2病毒。待确定动物初次感染建立成功后，持续监测病毒载量和疾病表型，在所有动物疾病恢复后，即初次感染后28天，再次经气管途径给予1毫升体积，106 TCID50 SARS-CoV-2病毒，创建新冠病毒再感染恒河猴模型。 3.样本收集和检测：按照以下实验方案对动物进行监测和样本采集，记录体重、体温、临床体征；采集鼻/咽/肛拭子，测定病毒RNA；采集外周血，检测血液学和免疫细胞变化；胸片观察肺部病变情况；采集血清，进行特异性抗体检测，并在相应时间点进行安乐死和尸检，检测病毒组织分布及病理改变。 图1实验设计及样本收集

[1]Deng W(#), Bao L(#), Liu J(#), Xiao C(#), Liu J(#), Xue J(#), Lv Q(#), Qi F, Gao H, Yu P, Xu Y, Qu Y, Li F, Xiang Z, Yu H, Gong S, Liu M, Wang G, Wang S, Song Z, Liu Y, Zhao W, Han Y, Zhao L, Liu X, Wei Q, Qin C*. Primary exposure to SARS-CoV-2 protects against reinfection in rhesus macaques. Science. 2020 Aug 14;369(6505):818-823.

众所周知，哮喘等过敏性疾病都具有复杂的病因，是环境和遗传共同作用的结果。长期外来刺激影响下，诱导患者某些基因的表达发生改变，引发支气管上皮细胞异常损伤，然后出现细胞凋亡，最后导致气道慢性炎症和哮喘的发生[7-11]。这些外来刺激包括环境烟雾、大气污染物、吸入变应原（如屋尘螨）、化学刺激物、病毒等。在相同的外界刺激下，如即使是在空气严重污染的重工业城市，也是只有少部分人发展成为哮喘患者，这就说明个人的遗传基础，即内因（哮喘易感性）是哮喘发生的关键因素。目前认为哮喘是一种有明显家族聚集倾向的多基因遗传性疾病，即哮喘的发生有患者的遗传基础。哮喘患者亲属发病率高于群体平均发病率。通过对比家族群间的遗传差异可以筛选出哮喘易感候选基因，为哮喘的早期预防和治疗提供依据。

（1）将galectin-7CDNA序列输入网上的基因沉默片断选择软件，选择沉默的发夹DNA。DEFINITION  Mus musculus lectin, galactose binding, soluble 7 (Lgals7)CDNA C A G C G A C T G G C C A C A T T G T GATGGAAAGGGAGGAGCTGAACCACTACCTTGCCTTTACTTAAGGTCCCCTCCCACAGCGACTGGCCACATTGTTGCTGTATTGCTGTGCCCGCCATGTCTGCTACCCAGCACAAGACCTCCCTGCCTCAGGGCGTCCGCGTGGGCACTGTCATGAGAATTCGAGGCATGGTCCCTGACCAGGCTGGCAGGTTCCATGTAAACCTGCTATGCGGTGAGGAGCAAGGAGCAGATGCCGCCTTGCACTTTAACCCGAGGCTGGACACTTCCGAGGTTGTCTTCAACACCAAAGAACAAGGCAAATGGGGCCGTGAGGAGCGAGGCACCGGCATCCCCTTCGAGCGTGGGCAGCCCTTTGAAGTGCTCCTCATCGCCACAGAGGAAGGCTTCAAGGCTGTGGTCGGGGATGACGAATATCTCCACTTCCACCACCGGATGCCGCCCGCGCGCGTGCGCTTGGTGGAGGTGGGCGGAGACGTGCAGCTGCATTCAGTGAAGATCTTCTAAGCAAGGACCCAAGGGCGTGGCGGGTAGGGGTGGGGGTGTAGGATCGCAGAGGAGGGTTTTGGATGGCGAATAAAGTGTAGCTGTAGTTCTG （2）分别合成3个不同位置galectin-7CDNA的正义和反义发夹DNA。 （3）将正义和反义序列退火，并通过连接酶与基因沉默载体p-silencer5.1连接。 （4）通过酶切确定沉默载体构建完成 （5）通过细胞培养和基因沉默载体转染，检测不同发夹的基因沉默效率 基因沉默效率细胞水平上的Western检测 （6）选择沉默效果高的发夹，通过核基因注射把p-silencer5.1中的启动子和发夹基因转入小鼠的核基因（7）首建鼠仔代基因鉴定，利用PCR引物鉴定发夹基因是否转入。 基因沉默首建鼠PCR检测 上游引物5’ATCCTCCCTTTATCCAGC 3’ 下游引物 5’ GAGGGCCTATTTCCCATG  3’ 退火温度51度，产物大小392 BP （8）首建鼠仔代Western Blot鉴定基因的沉默效果。 沉默鼠Western Blot检测

Jing Tian, Ruxuan He, Yimu Fan, Qianqian Zhang, BaolinTian, Chunju Zhou, Chunyan Liu, Mingjing Song*, Shunying Zhao* Galectin-7 overexpression destroy airway epithelial barrier in transgenic mice. Integrative Zoology 2020; doi: 10.1111/1749-4877.124632 (1区 2.5).

急性放射病(acute radiation disease)是机体在短时间内受到大剂量(>1Gy)电离辐射照射引起的全身性疾病。外照射和内照射都可能发生急性放射病，但以外照射为主。外照射引起急性放射病的射线有γ线、中子和X射线等。

1. 实验动物 SPF级C57BL/6 雄性小鼠由中国医学科学院动物研究所提供。 2. 照射条件: 137Cs γ 射线辐射源购自加拿大原子能有限公司 (剂量率为0.76 Gy∙min−1), 小鼠接受全身一次性照射, 剂量为7.2Gy。 3. 观察30天生存率 每日观察小鼠一般状况，称重； 4. 实验取材 照射 24 h 后颈椎脱臼处死小鼠, 取小肠组织, 依次用预冷PBS、10%中性福尔马林冲洗内容物。然后将小肠切成小段, 用医用透气胶带成捆包扎, 固定, 24 h 后脱水并制作石蜡块。 5.HE 染色和免疫组化实验小肠组织HE 染色采用传统实验方法。镜下通过形态学变化计数小肠隐窝内凋亡细胞数量。小肠组织内几种蛋白表达检测参考试剂说明书采用免疫组化两步法检测。主要步骤: 脱蜡, 0.1 mol∙L−1柠檬酸盐95 ℃修复30 min, 10%过氧化氢室温孵育10 min, 第一抗体4 ℃孵育过夜,第二抗体37 ℃孵育30 min, DAB 显色, 苏木素复染, 脱水封片。然后盲法镜下计数每只小鼠50 个完整小肠隐窝阳性细胞数。完整隐窝标准: 切面在隐窝中心,可见清晰、完整的隐窝腔, 隐窝底部有4～6 个分泌细胞, 分泌细胞至隐窝顶部每侧至少有10 个隐窝上皮细胞。 6. 数据处理 生存率用百分数表示, 两组间比较采用卡方检验。其他数据以x ± s 表示, 组间比较采用t 检验。

1.常建辉，等. P38抑制剂SB203580对小鼠辐射致死效应和小肠损伤的保护作用.药学学报，2011,46（4）：395-399 2.Wang Y，et al. Activation of nuclear factor kappaB in vivo selectively protects the murine small intestine against ionizing radiation-induced damage. Cancer Res, 2004, 64(17): 6240-6

放射性肺损伤（Radiation-induced Pulmonary Injury）又称放射性肺炎（radiation pneumonia），是由于对胸部的恶性肿瘤进行放射治疗引起的并发症，最多见于对肺癌、乳腺癌，其次是对食管癌、纵隔恶性肿瘤的放疗。放射治疗后在放射野内的正常肺组织受到损伤而引起的炎症反应。轻者无症状，炎症可自行消散；重者肺脏发生广泛纤维化，导致呼吸功能损害，甚至呼吸衰竭。

1. 实验材料  C57BL/6雄性小鼠（SPF级）由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，合格证号[SCXK(京)2015-0035]，体重20.0-22.0 g，周龄8-12。 2.照射条件 X线生物辐照仪（RS2000，美国Rad Source Technologies）照射，照射剂量为17 Gy，剂量率为3.12 Gy/min。照射面积为1.5 cm2，源皮距为15 cm。 3. 组织处理、切片 C57小鼠肺组织取材固定于4% 的中性甲醛24 h，修块至肺组织最大横截面，脱水后制作石蜡块。用石蜡组织切片机制作4 µm的切片，切片常规HE染色、Masson染色、免疫组织化学，封片后用正置显微镜（BX51，Olympus，Japan）观察。 4.HE染色 组织切片在病理平台进行苏木素-伊红常规染色。HE染色后进行镜下观察。病理学镜检人员对小鼠受照侧肺组织组织切片进行单盲评分。来自于动物的右肺的全部被检玻片均随机化检测。这一评分系统由一个0~12分范围的可数评分组成，每张切片，由肺泡间隔增宽、肺泡腔内纤维化渗出的严重度、血管周围炎细胞浸润的程度进行分类评分，每种分类根据病变程度又分为：0分为正常；1分为轻度；2分中度；3分重度；4分极重度。合并后记分。 5.Masson染色  肺组织切片在病理平台常规处理，进行Masson复合液染色，结果细胞核染黑蓝色，胶原纤维呈绿色，神经胶质纤维、肌纤维、红细胞呈红色。图像用单反数码相机（D90，Nikon，Japan）进行采集，肺组织横截面积用Image-Pro Plus 5.1（IPP，Media Cybernetics，Inc. USA）软件进行计算，结果用胶原沉积面积占组织总面积的比值表示。 6.肺羟脯氨酸含量测定  冷冻肺组织制备匀浆。使用羟脯氨酸比色分析试剂盒（BioVision，Milpitas，CA）测量匀浆中的胶原蛋白含量。数据以每毫克肺匀浆蛋白质的微克羟脯氨酸表示。 7.小鼠纤维化相关基因PCR检测 于照射后8周、16周、23周取小鼠右肺中叶，每组3只，迅速保存于-80℃冰箱，样本处理后按照试剂盒提供的实验步骤进行基因表达测定分析。

1.Pan J, Li D, Xu Y, Zhang J, Wang Y, Chen M, Lin S, Huang L, Chung EJ, Citrin DE, Wang Y, Hauer-Jensen M, Zhou D, Meng A. Inhibition of Bcl-2/xl With ABT-263 Selectively Kills Senescent Type II Pneumocytes and Reverses Persistent Pulmonary Fibrosis Induced by Ionizing Radiation in Mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2017 Oct 1;99(2):353-361. doi: 10.1016/j.ijrobp.2017.02.216. Epub 2017 Mar 4. PMID: 28479002; PMCID: PMC6853175.Oct 1;99(2):353-361. 2.Xing Y, Zhang J, Lu L, Li D, Wang Y, Huang S, Li C, Zhang Z, Li J, Meng A(*). Identification of hub genes of pneumocyte senescence induced by thoracic irradiation using weighted gene coexpression network analysis. Mol Med Rep. 2016 Jan;13(1):107-16. 3.陈孟毅，孟爱民. 肺纤维化动物模型及研究进展. 中国比较医学杂志，2016, 26(6):88-93

骨髓抑制是指骨髓中的幼稚造血细胞活性下降。外周血的红细胞和白细胞都源于骨髓中的造血干细胞。外周血血细胞寿命短，常常需要不断补充。为了达到及时补充的目的，需要造血干细胞、造血祖细胞必须快速分裂。化学治疗（chemotherapy）和放射治疗（radiotherapy）以及许多其它抗肿瘤治疗方法，都是针对快速分裂的细胞，因而常常导致正常骨髓抑制。

1.实验小鼠 SPF级雄性C57小鼠35只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供［SCXK（京）2014-0004］。饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所屏障环境动物房［SYXK（京）2015-0035］，实验方案通过医学实验动物研究所实验动物管理和使用委员会（IACUC）审批，IACUC号为：MAM16003。动物实验经过福利伦理审查，符合3R原则。 2. 小鼠分组和给药 白消安（busulfan）购自于sigma。白消安粉末由DMSO配置为80mg/ml作为母液贮存，使用时用PBS稀释为所需浓度。小鼠分为对照组，低剂量给药组（20mg/kg）和高剂量给药组(40mg/kg)，每组5只。腹腔注射，高剂量给药组分两天给药，每天给予20mg/kg。对照组小鼠给予等体积含5%DMSO的PBS作为对照。 3. 造血干细胞和造血祖细胞比例测定 分离的骨髓细胞，调整细胞浓度到1´ 107/ml，每只小鼠取100ul细胞用于后续染色。按体积比1:50加入biotin标记的混合一抗抗体CD4，CD8， B220，Ter119，Gr1，CD11b，均购自BD bioscience，4℃条件下孵育30min，PBS洗涤一次，离心条件为1400r/min，5min。离心后弃去上清，保持100ul体积，加入混合抗体Streptavidin（percp标记），scal-1（PE标记），ckit（APC标记），CD34（FITC标记），以上抗体均购自BD bioscience。4℃条件下孵育1h。之后PBS洗涤两次，离心条件如上。BD流式细胞仪（FACS AriaTMII，BD）检测造血祖细胞（Lin-c-kit+ Sca1-or LKS- cells），造血干细胞（Lin- c-kit+ Sca1+ or LKS+ cells），长期造血干细胞（CD34-Lin-c-kit+ Sca1+）在骨髓中所占的比例。 4.骨髓细胞计数 小鼠分组和给药方式如上述，白消安给药后15天小鼠CO2安乐死，75%酒精浸泡消毒，之后在无菌的条件下取小鼠单侧股骨，用含2％FBS的PBS缓冲液冲洗骨髓，将单侧股骨冲洗至2mLEP管中，保持体积为1ml，每只小鼠取10ul用于骨髓细胞计数。 5.粒细胞集落形成能力测定（colony forming unit-granulocyte and marchrophage， CFU-GM）  CFU-GM实验通过检测粒细胞巨噬系细胞的集落形成能力，用来检测造血祖细胞分化为粒细胞巨噬细胞的能力。无菌取小鼠骨髓细胞，用PBS将小鼠骨髓浓度调整至4×105/ml，每个样加0.2ml 细胞至事先分装好的2ml M3534培养基中，振荡器充分混匀，静置2～5min，待气泡消失。加入24 孔板，每孔0.5ml。轻摇培养板，使培养基均匀分布。将培养板放入湿盒，置入37ºC，5％CO2 培养箱中。培养第7天在倒置显微镜下观察。低倍观察集落形成情况，细胞数≥50 为阳性集落。 6.外周血计数  用抗凝管收集外周血。自动血细胞计数仪（ABX pentra DX 120，法国）测定外周血中白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指标。 7.单细胞集落能力检测 本方法依据前期发表文章[8, 9]，分离的骨髓细胞，调整细胞浓度到1´ 107/ml，每只小鼠取100ul细胞用于后续染色。按体积比1:50加入biotin标记的混合一抗抗体CD4, CD8, B220，Ter119，Gr1，cd11b，4℃条件下孵育30min，PBS洗涤一次，离心条件为1400r/min，4℃，5min。离心后弃去上清，保持100ul体积，加入混合抗体Streptavidin（percp标记），scal-1（PE标记），ckit（APC标记），CD34（FITC标记）。4℃条件下孵育1h。之后PBS洗涤两次，离心条件如上。BD流式细胞仪（FACS AriaTMII，BD）分选长期造血干细胞（CD34-Lin-c-kit+ Sca1+）到提前加了100ul甲基纤维素培养基（Gibco MAM HS001）的96孔板中。每个孔两个细胞，待接种分选造血干细胞，37℃，5%CO2培养箱培养15天，低倍观察集落形成情况，细胞数≥50 为阳性集落，结果计算每组阳性孔比例。 8. 统计学分析 采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差误（mean±SEM）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way AVOVA）和Tukey 多重比较法（Tukey's Multiple Comparison Test），重复测量数据采用重复测量数据方差分析方法。P<0.05差异有统计学意义。

1.李程程, 管博文, 苏路, 党女, 王玉全, 孟爱民. 白消安对小鼠造血干细胞功能的损伤作用[J]. 中国比较医学杂志, 2018, 28(2):26-32 2.党女,卢延华,管博文,孟爱民. 白消安对2型糖尿病 KKAy小鼠外周血细胞及骨髓细胞的影响[J]. 中国比较医学杂志, 2020, 30(1):45~50.

固有免疫是机体防御外来病毒感染的第一道防线，通过识别病原并产生各种细胞因子、趋化因子、干扰素（IFN）等多种抗病毒因子。干扰素诱导的跨膜蛋白（IFITM家族），是一类具有抗病毒作用的ISG（干扰素诱导基因）的编码产物，并证明其在多种生物过程中发挥作用，具有广泛的抗病毒作用，并在免疫信号转导、细胞归巢等发挥作用。 IFITM家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7和IFITM10，除了IFITM5特异性表达与骨细胞，不依赖与IFN的表达，其余家族在IFN的调控下在多组织和器官广泛表达。其中，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10在人类中表达，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6在小鼠中表达（图1）。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 C57BL/6购自北京维通利华实验动物技术有限公司  SCXK(京）2016-0006。超排用雌鼠数量10-15只，年龄3周龄，交配传代用野生型鼠为成年8-10周龄小鼠。实验中基因工程小鼠由本实验室繁殖产生。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18004.    3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 激光共聚焦扫描显微镜 Leica 流式细胞仪 BD 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD Realtime PCR仪 ABI 冰冻切片机 Leica 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 组织匀浆机 POLYTRON 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa  T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa  胶回收试剂盒 Qiagen  质粒提取试剂盒 Axygen  Trizol试剂 Invitrogen  逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen  北京全式金生物科技有限公司 GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 Beyotime BCA试剂盒 Beyotime Western blot 洗液（10×） Beyotime 30%Acr-Bis Beyotime SDS-PAGE电泳液 Beyotime Western blot转膜液（粉剂） Beyotime TEMED Beyotime 过硫酸铵 Beyotime 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 Beyotime 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 Beyotime 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 Anti-Flag sc-166384   3.1.4模型构建流程 利用CRISPR/Cas9技术制备IFITM6敲除小鼠。选择敲除第二外显子，来构建IFITM6敲除小鼠 (B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)。该基因敲除的杂合子小鼠，相互杂交可以获得该基因敲除的纯合子小鼠，使用PCR方法进行基因型鉴定。 3.1.5 IFITM6敲除小鼠的建立 3.1.5.1 IFITM6敲除小鼠模型的建立 （1）设计方案 图 1.IFITM6敲除小鼠模型构建设计方案 （2）构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。 靶点1: M- Ifitm6-EA1-g-up: TAGGACTGGGATCTGGTATAGG M- Ifitm6–EA1-g-down: AAACCCTATACCAGATCCCAGT   靶点2: M- Ifitm6-EB1-g-up: TAGGGAGAATGCCCAGGGATTC M- Ifitm6–EB1-g-down: AAACGAATCCCTGGGCATTCTC合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。 （3）构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。 （4）显微注射 1）超数排卵：10-15只3周龄雌鼠注射激素进行超排。 2）受精卵注射：取约120枚受精卵进行注射。 3）受体鼠制备：8-10周龄雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 4）胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，120枚卵，5只受体鼠）。 （5）基因型鉴定 1）剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 2）基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA 3）PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。 （6）结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。 （7）根据测序结果确定IFITM6敲除小鼠模型(B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)用于后续实验。   3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析 获得F0代后，首先通过与野生型鼠进行杂交，进行基因修饰鼠传代能力分析。获得能够传代的杂合子小鼠进行相互杂交，产生纯合敲除小鼠并用于后续实验。 图 2. IFITM6敲除小鼠的繁育   3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取 在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒（全式金）说明书按以下程序操作。 （1）加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。 （2）12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。 （3）加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。 （4）将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 （5）加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 （6）重复步骤（5）一次。 （7）加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。 （8）重复步骤（7）一次。 （9）10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。 （10）将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

心力衰竭，简称心衰，是指由于心脏收缩和（或）舒张功能障碍，无法将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统灌注不足，从而引发心脏循环障碍症候群，心衰并不是一个独立的疾病，而是所有心血管疾病发展的终末阶段。近年来，随着我国社会老龄化和高血压，冠心病等心血管疾病发病率的增加，使得心衰呈现高发病率，高致残率和高死亡率的特点，《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中报道我国心衰患病率为0.9%，有1000万左右的心衰患者。 几乎所有的心血管疾病最终都会导致心衰的发生，而在基础性心脏病的基础上，一些因素亦可诱发心衰的发生，常见诱因包括，感染，严重心律失常，心脏负荷增大，药物中毒（如洋地黄）等等。 心衰在临床上可分为急性心衰和慢性心衰。临床表现，包括呼吸困难，运动耐力下降，心室腔增大，心脏功能下降（LVEF<40-50%），心脏顺应性降低，心室腔内淤血，肺循环及体循环淤血。 临床检查手段，包括超声影像分析，心电图，心衰标志物（B型利钠肽（BNP），N末端B型利钠肽原（NT-proBNP））心肌坏死标志物（心肌肌钙蛋白T（cTnT）及心肌肌钙蛋白I（cTnI））。 临床治疗方法，包括强心（米力农，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重构（卡维地洛）及心脏移植。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003. 3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 Vevo770小动物超声影像系统 VisualSonics 激光共聚焦扫描显微镜 Leica 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD 组织脱水机 Leica 石蜡切片机 Leica 石蜡包埋机 Leica 冰冻切片机 Leica 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 组织匀浆机 POLYTRON 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa  T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa  胶回收试剂盒 Qiagen  质粒提取试剂盒 Axygen  Trizol试剂 Invitrogen  逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen  北京全式金生物科技有限公司 DNMT1（MA5-16169）抗体 Invitrogen GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 Beyotime BCA试剂盒 Beyotime Western blot 洗液（10×） Beyotime 30%Acr-Bis Beyotime SDS-PAGE电泳液 Beyotime Western blot转膜液（粉剂） Beyotime TEMED Beyotime 过硫酸铵 Beyotime 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 Beyotime 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 Beyotime 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠。在DNMT1基因第1外显子两端插入两个loxP位点来构建DNMT1flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。 3.1.5 DNMT1条件性敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的建立 3.1.5.1 DNMT1条件性敲除大鼠模型的建立   （1）设计方案 图 1. DNMT1条件性敲除模型构建设计方案 （2）构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。 靶点1: GCCTCCTGAGCAAGTGCT   GGG R- DNMT1-gRNA UP1        5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT R- DNMT1-gRNA DOWN1    5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC 靶点2: AGCCCTGAACTCCTTATG   TGG R- DNMT1-gRNA UP2        5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG R- DNMT1-gRNA DOWN2    5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT （3）合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。 （4）构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。 （5）显微注射 1）超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。 2）受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 3）雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。 4）受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 5）胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。 （6）基因型鉴定 1）剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 2）基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA 3）PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。 （7）结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。 （8）根据测序结果确定Isca1条件性敲除模型大鼠（SD. DNMT1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。   3.1.5.2 心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠（DNMT1flox/flox/MHC-Cre）的建立   根据3.1.5.1获得DNMT1flox/+大鼠F1代后，首先通过8周龄左右DNMT1flox/+与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的DNMT1flox/+大鼠。与此同时使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与αMHC-Cre大鼠（SD. Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周龄左右DNMT1flox/+大鼠与DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠进行第二轮杂交，可得到DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠，用于后续实验。 图 2. DNMT1 flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育   3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取 在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。 （1）加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。 （2）12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。 （3）加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。 （4）将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 （5）加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 （6）重复步骤（5）一次。 （7）加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。 （8）重复步骤（7）一次。 （9）10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。 （10）将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

Wu TT, Ma YW, Zhang X, Dong W, Gao S, Wang JZ, Zhang LF, Lu D. Myocardial tissue-specific Dnmt1 knockout in rats protects against pathological injury induced by Adriamycin. Lab Invest. 2020 Jul;100(7):974-985. (IF=4,197)

骨发育异常老年样皮肤（gerodermia osteodysplastica 或geroderma osteodysplasticum, GO症），又称瓦迪侏儒症（Walt Disney dwarfism），OMIM231070，是遗传性皮肤松弛症（Cutis laxa，CL）的一种，主要累及皮肤、骨骼等组织器官，是一种常染色体隐性遗传的罕见病。。Hennies 等针对13 个家系的研究发现GO 症的发病与一个高尔基体蛋白GORAB 的突变有关。GO 症和其他皮肤松弛症（CL）类似，主要累及结缔组织，这类疾病主要的可见临床表现就是皮肤缺乏弹性、松弛下垂，具有高度的异质性。

构建Gorab条件敲除小鼠（Gorabflox/flox）与Prrx1cre工具小鼠交配，得到Gorab腹部皮肤条件敲除小鼠Gorabflox/flox; Prrx1crehet小鼠

手足口病是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病，主要传播途径是粪口传播，多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的，轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹，多数患儿一周左右自愈；但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），主要由肠道病毒（enterovirus）、柯萨奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）组成。自2008年在新加坡的暴发流行，柯萨奇病毒A10型（Coxsackievirus A10，CA10）成为手足口病主要致病血清型之一，由其感染引起的手足口病爆发事件在法国、芬兰、印度等国家和地区不断被报道。在我国，2013年以前主要流行的手足口病病原以EV71和CA16为主，CA6和CA10次之；而在2013年以后，CA10引起的手足口病比例逐渐上升，成为国内手足口病感染的优势病原体之一。CA10共分为A～G的7个基因型，可根据各地流行株的序列信息进行核苷酸和氨基酸的同源性对比，从而分析CA10的流行情况。在我国，CA10近年来在多地区流行的病毒株保持着较高的同源性，与其他国家的分离株之间的同源性距离较远，具有地域分布特点以及一定的时间分布特点。CA10传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，在短时间内可造成较大范围的流行，疫情控制难度大。

1.病毒准备：CA10病毒(GenBank: MF688814.1)，由医院咽拭子分离得到，在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、扩增，并采用反复冻融法释放病毒，离心富集病毒。 （1）细胞病毒培养操作： RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶，培养至融合度约80%；感染前弃去原培养基，细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA10病毒后，置于37℃ 5% CO2培养箱孵育1~2h；之后弃去无血清培养基，加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++～++++，将T75细胞瓶置封口袋中，-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中，4℃ 2000rpm离心20min，沉淀细胞碎片。吸取病毒上清，分装后冻存，并测定病毒滴度TICD50。 （2）组织病毒培养操作： 将CA10病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。 2.实验动物：采用SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。CA10动物模型建立实验通过IACUC审核，符合动物实验要求。 病毒感染：根据预实验确定的感染剂量，即107 TCID50 CA10病毒，将病毒经灌胃途径感染小鼠，感染剂量为100μl。对照组灌胃同等量的PBS。

黑色素瘤指有恶性变化的色素斑痣，是由交界痣或混合痣性质的痣发展而来。虽然不一定由斑痣恶变，但是慢性刺激和不恰当的治疗对斑痣转变成黑色素瘤有很大的关系。黑色素瘤表现为黑痣突然出现或迅速长大，色泽不断加深，四周出现彗星状小瘤或色素环，局部发生疼痛、感染、溃疡或出血，出现肿大的淋巴结。肿瘤为单一实性，常有包膜，颜色可黑色、红棕色，深浅程度不一，也可无色素性。大多数黑色素瘤是原发性的，累及成人和儿童，特别是有神经皮肤症状的儿童。肿瘤好发于下肢，其次是头、颈、上肢、眼、指甲下和阴唇等处。早期即能由淋巴道和血行转移至肝、脑、骨、黏膜等处。经常受摩擦的手掌、足底和眼部的黑痣以及位于表皮和真皮交界处的黑痣容易恶变，被认为是黑色素瘤的前驱期。

（一）构建GPR68-FloxP小鼠 1、实验设计 GPR68只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将FloxP基因插入GPR68基因两端。 图2 插入位点设计 2、Cas9/gRNA的活性检测 采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测gRNA靶点体外酶切活性。选体外活性高的gRNA显微注射受精卵，取胚胎检测内源活性。根据Cas9/gRNA的内源活性结果，选用活性较高的gRNA进行后续实验。 3、构建同源重组模板（Donor质粒） 根据靶点的位置设计并构建Donor DNA。 4、基因敲除小鼠的建立和和品系交配GPR68-FloxP小鼠的构建 将Cas9nickase、 GPR68-L1和GPR68-R1体外转录成mRNA和RNA后，加上Donor DNA显微注射到小鼠的受精卵中，以高效获得基因敲入的小鼠。采用直接注射受精卵实现基因敲除，由于在受精卵发育早期，甚至单细胞时期就发生基因敲入，因此小鼠嵌合率高，小鼠传种的几率比囊胚注射ES Cell高。 小鼠出生2周后，剪鼠尾，提取基因组DNA进行PCR加上测序检测小鼠基因型，测序检测是否实现了两个位点的FloxP精确插入。 5、CD4+T细胞特异性敲除GPR68小鼠的构建 图3 GPR68-FloxP小鼠与CD4-Cre小鼠杂交 将GPR68-Flox/Flox小鼠与CD4-Cre小鼠杂交，子代小鼠即为CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠。 （二）皮下移植黑色素瘤模型的构建 1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。 2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×106个/mL，接种体积控制在0.2mL。 3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。 4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b2/2(a为长轴，b为短轴)。 5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量。

[1]李维莎,刘宏飞,严立波,等. OGR1与肿瘤微环境 [J]. 中国比较医学杂志, 2019, 29(7):96-101. [2]Wenlong Zhang,Yong Han,Weisha Li，et al. Clinical data analysis reveals the role of OGR1 (GPR68) in head and neck squamous cancer[J]. Animal Models and Experimental Medicine，2020 Mar 18;3(1):55-61.

正常情况下，人体免疫系统对自身成分不会产生反应，称自身免疫耐受。自身免疫性疾病是机体自身免疫耐受机制失调或破坏，导致自身组织器官损伤或出现功能异常的免疫病理状态。自身免疫性疾病种类很多，其诱因和临床表现各不相同，但多呈反复发作和慢性迁延趋势，严重影响患者的工作和生活质量。 自身免疫性疾病典型症状： 多器官系统受累，可有发热、面部红斑、关节痛、脱发、口腔溃疡等，可累及肾脏、血液系统、心血管及神经系统等。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 本实验使用SPF级C57BL及ICR小鼠，购买于北京维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2012-001】并在本所SPF级动物屏障环境动物房[SYXK(京)2015-0035]中长期饲养繁殖。涉及动物操作程序和动物实验经本所动物使用与管理委员会（IACUC）批准，批准号为BL18003。 3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf MRI 西门子 PET/CT 西门子   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa  T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa  胶回收试剂盒 Qiagen  质粒提取试剂盒 Axygen  Trizol试剂 Invitrogen  逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen  北京全式金生物科技有限公司 MBP（MAB42282）抗体 R&D GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 碧云天 BCA试剂盒 碧云天 Western blot 洗液（10×） 碧云天 30%Acr-Bis 碧云天 SDS-PAGE电泳液 碧云天 Western blot转膜液（粉剂） 碧云天 TEMED 碧云天 过硫酸铵 碧云天 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 碧云天 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 碧云天 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。 3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立 3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立 （1）设计方案 载体构建 1，sgRNA 载体 载体名称：pUC57-sgRNA expression vector Addgene ID: 51132 根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基） targeting site 1: gggttcaaacacatctca    agg m-ctla4-gRNA up1      5’TAGGgggttcaaacacatctca m-ctla4-gRNA down1    5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC targeting site 2: gagacttctggaacatgg    aGg m-ctla4-gRNA up2      5’TAGGgagacttctggaacatgg m-ctla4-gRNA down2    5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的载体 sgRNA插入位点示意图 图1 CTLA4敲除小鼠模型构建设计方案 构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1354） 2，CAS9 载体 载体名称：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 Addgene ID: 44758 载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1345） 显微注射 1，超数排卵：15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。 2，受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 3，雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。 4，受体鼠制备：8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 5，胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 120枚卵，4只受体鼠）。 基因型鉴定 1，剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 2，基因组DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA 3，PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基） M-CTLA4-KO-S    5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG     M-CTLA4-KO-A    5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC      KO： TM=62℃       WT：727bp    ko: (见测序分析) PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A） 反应体系： 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus) 2.0 μl dNTP Mixture(2.5 μM) 1.6 μl 引物-S（50 μM ） 0.2 μl 引物-A（50 μM ） 0.2 μl 模板DNA 2.0 μl LA Taq 0.2 μl 补加ddH2O至总体积 20.0 μl 扩增程序： 95℃ 15 min； 95℃,          30 s TM-2℃,         30 s 72℃,           2 min 30循环； 72℃ min； 6×loading buffer 终止反应。 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。 4，结果分析： 选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示)，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。    1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR结果） 1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（KO  PCR结果）   5，测序结果： KO：4#，6#，7#，10#，15#    灰色为缺失部分 4# agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg 6# agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg 7# agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg 10# agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg 15# agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg   3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析 获得F0代后，首先通过与野生型C57小鼠进行杂交，进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得CTLA4敲除小鼠纯合子小鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。 3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定 在幼崽出生后剪脚趾标记，并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒（bimake）说明书按以下程序操作。 1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：   （单样本） Protease Plus 2 μL Buffer L 100 μL 组织消化液现用现配，充分混匀后使用。 1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。 1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。 2. PCR扩增 2.1. PCR反应体系： PCR 反应组分 20 μL 反应体系 (μL) 50 μL 反应体系 (μL) ddH2O 8 21 正向引物 (10 μM) 0.5 1 反向引物 (10 μM) 0.5 1 模板（消化产物） 1 2 2 x M-PCR OPTI™ Mix 10 25 注：模板体积可以适当调整。 2.2. PCR反应条件： 温度 (℃) 时间 循环数 94 5 min 1 94 20 sec 35 60 30 sec 72 X min (2kb/min) 72 5 min 1 12 -- 1 3. 琼脂糖凝胶电泳 试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。

在正常的免疫过程中，T细胞的有效激活是其能发挥免疫效应的前提及保证，若T细胞的活化不完全或者处于免疫应答无能状态时，则不能发挥杀灭肿瘤细胞的作用。T细胞的活化需要双信号同时刺激，即第一信号和第二信号的协同作用。第一信号来自于APC细胞表面的抗原肽-MHC复合物和T细胞表面的相对应受体相结合所传导，第二信号来自于APC细胞表面的共刺激分子与T细胞表面的相对应受体相结合所传导。 目前已经知道的最主要的共刺激分子是B7-1和B7-2，他们所对应T细胞表面受体为CD28，他们结合传递的是刺激性第二信号，和第一信号协同刺激T细胞的活化。近年来的研究发现，CTLA4与CD28会竞争性的与B7蛋白家族相结合，并且CTLA4与B7蛋白结合的亲和力是CD28的二十多倍，他们结合后在免疫反应的前期阶段传递抑制性信号，导致T细胞的活化受到抑制。免疫检验点CTLA4相当于是机体进化出来的刹车机制，它在维持免疫内稳态及防止免疫系统用力过猛之间发挥着重要作用，肿瘤细胞可以通过激活CTLA4信号通路从而躲避机体的抗肿瘤免疫效应。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 本实验使用SPF级C57BL及ICR小鼠，购买于北京维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2012-001】并在本所SPF级动物屏障环境动物房[SYXK(京)2015-0035]中长期饲养繁殖。涉及动物操作程序和动物实验经本所动物使用与管理委员会（IACUC）批准，批准号为BL18003。 3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf MRI 西门子 PET/CT 西门子   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa  T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa  胶回收试剂盒 Qiagen  质粒提取试剂盒 Axygen  Trizol试剂 Invitrogen  逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen  北京全式金生物科技有限公司 MBP（MAB42282）抗体 R&D GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 碧云天 BCA试剂盒 碧云天 Western blot 洗液（10×） 碧云天 30%Acr-Bis 碧云天 SDS-PAGE电泳液 碧云天 Western blot转膜液（粉剂） 碧云天 TEMED 碧云天 过硫酸铵 碧云天 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 碧云天 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 碧云天 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因人源化小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。 3.1.5 CTLA4人源化小鼠的建立 3.1.5.1 CTLA4人源化小鼠模型的建立 （1）设计方案 一、载体构建 1，sgRNA 载体 载体名称：pUC57-sgRNA expression vector Addgene ID: 51132 根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基） targeting site 1: gggttcaaacacatctca    agg m-ctla4-gRNA up1      5’TAGGgggttcaaacacatctca m-ctla4-gRNA down1    5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC targeting site 2: gagacttctggaacatgg    aGg m-ctla4-gRNA up2      5’TAGGgagacttctggaacatgg m-ctla4-gRNA down2    5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的载体 sgRNA插入位点示意图 图1 CTLA4人源化小鼠模型构建设计方案 构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1354） 2，CAS9 载体 载体名称：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 Addgene ID: 44758 载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1345） 显微注射 1，超数排卵：15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。 2，受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 3，雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。 4，受体鼠制备：8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 5，胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 120枚卵，4只受体鼠）。 基因型鉴定 1，剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 2，基因组DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA 3，PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基） M-CTLA4-Ki-S1    5’CTACCACTGAGCTACATCTATACCTCTGAG    M-CTLA4-Ki-A1    5’GCCACGTGCATTGCTTTG   M-CTLA4-Ki-S2    5’GGAACCCAGATTTATGTAATTGATCC     M-CTLA4-Ki-A2    5’TTATTGGATAGTCAGCTGGTGTGC       M-CTLA4-KO-S    5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG     M-CTLA4-KO-A    5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC      KI: TM=62℃      上游目的片段（S1-A1）： 1101bp               下游目的片段（S2-A2）： 1254bp KO： TM=62℃       WT：727bp    ko: (见测序分析) PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A） 反应体系： 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus) 2.0 μl dNTP Mixture(2.5 μM) 1.6 μl 引物-S（50 μM ） 0.2 μl 引物-A（50 μM ） 0.2 μl 模板DNA 2.0 μl LA Taq 0.2 μl 补加ddH2O至总体积 20.0 μl 扩增程序： 95℃ 15 min； 95℃,       30 s TM-2℃,      30 s 72℃,       2 min 30循环； 72℃ min； 6×loading buffer 终止反应。 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。 4，结果分析： 选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示)，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。    1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR结果）     1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（下游PCR结果） 5，测序结果： KI：3#，5#，9#，14#，23# 黄色绿色为检测引物，蓝色字体为同源序列，红色为H-CTLA4基因ORF，灰色为BGH poly A ctaccactgagctacatctatacctctgagctgtgtcttcattgctgaggtatatgaactacgtctctatcactgagctgtgcctccaagttttaagtttctacctttgaaaatttttactattttttttaaaagcccatcctcctgtggaggttttaaatgtcttttcatttggattgactttctctgggccatccacaactttattttgccgttgttacagttttaaaagcatctggtttatttcccaacggacaaaaccagaggcccctttccctgttttgtgtgtgtgtgtttgtgtgtgcatatgtgtgcatgcatgtgcatgtacaaatgtgtgtgtgtctttcatttcttgtgattttggcatttttctctcagtaaaatactaagtggagttaggcaaaaataaacccttttgtgtactgaggggctcatagaaggacacaatttttcttggtgccttccaaagagaaattcagacatcagctccaggactaagagggatggccatgggacgctaagtaagagtactgggggattaaagatgaccagatgactggataaagttgggactgggatttagggattccttgtactacagaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaAgcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccgccaccatggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaattgaCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaaggaaccatgagagttccttaagtcccatatgggggagaacaagttctttgtcactgctagaaaatcctgtaaagttaagagatttaaggggggcatttgaaatcgtgagtacatttgatcttgatatcacagtaacattaaggtttttctccttacccccaatcccacccccaaaacttacctaaattcaaataaataagaagttttcctcattcactttaagattttgagacactcttagttctttaaattatcacacctaaggcttaggggacatagcagaagagggggcagaaagactatgagagccaaaggtacatagagtttactgagagattgtgtctcttaggatgtcaaatggtacacccataaagtctcaccaacacgactgcctaaacttgagctgaataaggacatgaataacaatagacatacccaagtggatggggaaagaccaagatgcttcagcactatagcaataactacaggaagccaaggaatatggagagtaggaaattgccaagggaaaagcacaccagctgactatccaataa   3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析 获得F0代后，首先通过与野生型C57小鼠进行杂交，进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4人源化小鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得CTLA4人源化小鼠纯合子小鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。 3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定 在幼崽出生后剪脚趾标记，并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒（bimake）说明书按以下程序操作。 1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：   （单样本） Protease Plus 2 μL Buffer L 100 μL 组织消化液现用现配，充分混匀后使用。 1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。 1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。 2. PCR扩增 2.1. PCR反应体系： PCR 反应组分 20 μL 反应体系 (μL) 50 μL 反应体系 (μL) ddH2O 8 21 正向引物 (10 μM) 0.5 1 反向引物 (10 μM) 0.5 1 模板（消化产物） 1 2 2 x M-PCR OPTI™ Mix 10 25 注：模板体积可以适当调整。 2.2. PCR反应条件： 温度 (℃) 时间 循环数 94 5 min 1 94 20 sec 35 60 30 sec 72 X min (2kb/min) 72 5 min 1 12 -- 1 3. 琼脂糖凝胶电泳 试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。