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标识符 CSTR:16397.09.0L01001150
资源中文名称 人肺腺癌A549绿色荧光标记细胞BALB/c裸小鼠肿瘤模型
资源英文名称 A549-eGFP
疾病概述 肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌的一种,属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌,肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮,少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低,发病年龄较小,女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管,为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状,往往在胸部 X 线检查时被发现。表现为圆形或椭圆形肿块,一般生长较慢,但有时早期即发生血行转移。淋巴转移则发生较晚。腺癌是腺上皮恶性肿瘤,可以有腺泡、乳头、细支气管肺泡或实性生长方式。它常伴有黏液产生,检测黏液需要特殊的染色,尤其在检测分化差的肿瘤时。黏液的检测有时能够鉴别实性腺癌与其他形态表现一样的大细胞癌。
实验动物背景信息

A549细胞系来源于一位58岁肺癌男性患者,由D.J. Giard等人于1972年通过组织原代培养获得。M. Lieber等人的进一步研究表明A549细胞系能够通过胞苷二磷酸胆碱途径借助高不饱和脂肪酸合成卵磷脂,且该细胞免疫酶标染色呈现角蛋白阳性反应。

无胸腺裸鼠(Nude Mouse,简称裸鼠)目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力,目前已将nu基因导入不同近交系动物,成为系列动物模型,仅小鼠模型一种,已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷,在一定情况下,不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979~1980年的报导,已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功,目前已成功地将人结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比(35.7%)的良好生长,并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料,接种后的成活率更高(41%)。

本实验中所用鼠种BALB/c-nu/nu,系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后,交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠(BALB/c-nu/nu),雌鼠是有胸腺的杂合小鼠(BALB/c-nu/+)。采用BALB/c-nu/+♀与BALB/c-nu/nu♂随机交配法进行繁殖,已取得较好成果,裸鼠的生产性能良好:受胎率达81.5%,平均产仔率8.1只/窝,平均产裸仔率3.99只/窝,每窝平均成活3.62只仔鼠,9周龄仔鼠成活率100%,其主要项目数据与日本中央实验动物研究所(CLEA)和英国实验动物中心(LAC)发表的材料基本一致。

模型制作方法

模型制作采用BALB/cA-nu裸小鼠,鼠龄5周,体重15-18g,在无特定病原体(specific—pathogen free,SPF)的饲养间饲养。

4.1细胞培养:A549细胞为本实验室冻存

4.2构建带有筛选标记的载体:chicken-β-actin- promoter-eGFP

1绿色荧光表达载体的构建

4.3细胞转染和筛选:采用Lipofectamine 2000 Reagent转染A549细胞。转染后,用含G418的培养液筛选细胞,获得稳定表达GFP的细胞株,选择其中高表达的克隆株扩大培养(图2)。

2绿色荧光标记的A549-eGFP细胞系(200×)

稳定高表达GFP的细胞,在荧光显微镜下均呈强荧光,并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下,传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4.4肿瘤细胞的植入及活体荧光成像:收集处于生长对数期的高表达细胞株,进行裸鼠皮下接种,采用活体荧光影像系统摄像动态观察,并用Slide Book 4.0软件进行荧光光子数分析

模型表型数据


图3 皮下接种A549-GFP肿瘤生长影像分析

图4 荧光标记肿瘤生长曲线

应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光蛋白在裸小鼠皮下的稳定表达,从第1周至第5周,随着肿瘤移植时间的增加,表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大,荧光光子数也逐渐增加,移植瘤体积与荧光光子数成正相关(图3、图4)。

动物模型的评价与验证
保存方式 冷冻
合作方式
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备注 保存地点:中国医学科学院实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室