C57BL/6J小鼠

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建/蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。

（一）构建GPR68-FloxP小鼠

GPR68只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将FloxP基因插入GPR68基因两端。

图1 插入位点设计

（二）CD4+T细胞特异性敲除GPR68小鼠的构建

图2 GPR68-FloxP小鼠与CD4-Cre小鼠杂交

 将GPR68-Flox/Flox小鼠与CD4-Cre小鼠杂交，子代小鼠即为CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠。

（三）皮下移植黑色素瘤模型的构建

1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。

2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×10⁶个/mL，接种体积控制在0.2mL。

3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。

4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b²/2(a为长轴，b为短轴)。

5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量。

在无特殊刺激的情况下，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠没有明显表型，且外观与同背景WT小鼠无明显差异。分别从DNA、mRNA、蛋白水平检测CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠组织中GPR68表达，如图4所示，在此三个水平上均不能检测到GPR68。

图3 鉴定GPR68-/-小鼠组织中GPR68的表达

a.鼠尾DNA水平的鉴定；b. mRNA水平鉴定；c.蛋白水平鉴定

分别对WT与CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠进行皮下注射接种5×10⁵个B16细胞，观察并检测肿瘤生长情况。接种后第20天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠肿瘤重量体积等。如图5所示，与WT小鼠比较，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠能够明显抑制黑色素瘤的生长。

图4  CD4+ T 细胞GPR68敲除对黑色素瘤生长的抑制作用

1. 肿瘤大小；b.肿瘤重量；c.肿瘤体积

CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠外观表现与野生型C57BL/6J小鼠无明显差异，生理条件无异常表型； DNA、mRNA、蛋白水平检测CD4+T细胞中均无GPR68表达。

1. DNA鉴定

提取小鼠脾脏中的CD4+T细胞，采用全式金DNA提取试剂盒提取总DNA，进行PCR扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2. mRNA鉴定

    提取小鼠脾脏中的CD4+T细胞，采用赛默飞反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，通过Real time PCR鉴定小鼠CD4+T细胞中mRNA水平GPR68的表达情况。

3. 蛋白表达鉴定

提取小鼠脾脏中的CD4+T细胞，采用赛默飞蛋白定量试剂盒进行定量后通过Western blot鉴定小鼠CD4+T细胞中蛋白水平GPR68的表达情况。