ICR小鼠

1. 实验材料

1.1 实验动物

SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司，由母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。

1.2 主要实验仪器

Olympus光学显微镜

Thermo二氧化碳培养箱

Sigma低温高速离心机

海尔-20℃冰箱

SANYO -80℃超低温冰箱

ABI QuantStudio^TM 3荧光定量PCR仪

哈东联生物安全柜（型号：HDL）

高压灭菌锅（TOMY SX-700）

Eppendorf 离心机

Eppendorf 移液器

2. 实验操作规程和动物处理伦理

模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为LJN20013，简要步骤如下：

2.1 病毒准备：

CA16病毒（shzh05-1，GenBank: EU262658），2008年分离自深圳市，在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、扩增，并采用反复冻融法释放病毒，离心富集病毒。

2.1.1 细胞病毒培养操作：

RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶，培养至融合度约80%；感染前弃去原培养基，细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA16病毒后，置于37℃ 5% CO2培养箱孵育1~2h；之后弃去无血清培养基，加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++～++++，将T75细胞瓶置封口袋中，-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中，4℃ 2000rpm离心20min，沉淀细胞碎片。吸取病毒上清，分装后冻存，并测定病毒滴度TCID₅₀。

2.1.2 组织病毒培养操作：

将CA16病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。

2.2 病毒感染：

根据预实验确定的感染剂量，即病毒滴度为10⁸ TCID₅₀/mL的CA16毒株，将病毒经灌胃途径感染小鼠，感染剂量为100μl。对照组灌胃同等量的PBS。

1. 临床症状表型：

7日龄ICR小鼠灌胃感染CA16病毒5天后，开始出现不同程度的临床症状，症状由轻到重包括：驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，严重的直至死亡。临床症状评分持续升高，8dpi感染小鼠出现死亡。到观察期结束（12dpi）时平均临床评分为3分，存活率为60%（图1A，1B）。监测体重情况，发现感染小鼠体重增加未出现显著减缓，与未感染的对照小鼠不存在显著性差异（图1C）。

图1. ICR 7日龄乳鼠灌胃感染CA16病毒后症状观察

2. 血液和组织中病毒复制情况：

分析灌胃途径感染CA16的小鼠血液与组织中病毒载量发现，5dpi血液中病毒载量病毒载量高于3dpi（图2A），10³~10⁵ Copies/mg。小鼠中肌肉病毒载量变化与腹腔注射途径感染小鼠趋势相同，病毒载量在5dpi均有提升：由均值106 Copies/mg提升至均值10⁷ Copies/mg（图2B）。在其它组织中，CA16病毒载量明显偏低，未有组织病毒载量超过10⁴ Copies/mg（图2C）。

图2. ICR 7日龄乳鼠灌胃感染CA16病毒后血液和组织中病毒载量情况

3. 病理变化情况：

CA16病毒具有明显的嗜肌性，感染小鼠后肢肌肉中的病毒载量最高，且感染后的临床症状也表现为后肢的瘫痪症状，病理结果分析发现：骨骼肌病理损伤严重，具体表现为骨骼肌细胞变性坏死、炎细胞浸润（图3A）。除后肢肌肉外，脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡，少数神经元发生固缩现象。其他组织，包括脾、胸腺、心脏、肝脏、肺、肾、小肠组织均未见明显病理损伤。

综上可见，通过灌胃感染途径成功建立了CA16病毒感染小鼠模型，相较于腹腔感染途径其症状相对较轻，可以作为腹腔感染重症模型的补充，用于评价疫苗和药物。

图3. ICR 7日龄乳鼠感染CA16病毒后组织病理变化情况（HE染色）

1.临床症状观察：

在动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，属于部分疾病模型。参考其他手足口病原感染模型以及文献报道，动物感染CA16病毒后观察12天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准低动物进行临床评分打分：

0：未见异常；1：驼背或炸毛；2：后肢迟缓无力；3：单后肢瘫痪；4：双后肢瘫痪；5：死亡。根据临床评分标准，在灌胃感染CA16病毒观察期（12天）内，5dpi可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；8dpi出现死亡，在观察期结束时存活率为60%。

2. CA16病毒载量测定方法：实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。

采用的特异性引物：

CA16-F1 （5’-TAGGGACGCACGTGATCTGGGACTTCG-3’）

CA16-R1（5’-GCACCAATGGGAACTACATAGTTAGTTTG-3’）

经灌胃感染CA16病毒后，病毒在动物血液和肌肉中复制水平持续增高，在血液中检测值从均值10⁴ copies/μl升高到均值10⁵copies/μl，在肌肉中从均值10⁶ copies/mg上升到10⁷ copies/mg，说明病毒在血液和肌肉中都发生了扩增，尤其是肌肉中病毒载量明显高于血液，体现出典型的嗜肌性，与临床症状表现相吻合。在其他组织中，病毒载量大部分在检测阈值之上，但低于10⁴ copies/mg。

苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。

CA16病毒具有明显的嗜肌性，在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重，骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润。与后肢肌肉中的病毒载量最高、后肢瘫痪的临床症状相一致。除后肢肌肉外，脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡，少数神经元发生固缩现象，说明在小鼠CA16灌胃感染模型中也能出现神经性病变。