C57BL/6J小鼠

在本实验中，首先从Invitrogen公司获得含有Necl4的基因组DNA的BAC克隆，之后用诱导型Cre重组酶基因(CRE-ERT2)和新霉素耐药基因（NeoR）取代Necl4的第一外显子构建基因靶向载体。通过电穿孔方法将线性化的靶向载体导入小鼠胚胎干细胞（ES）中。在新霉素选择后，用限制性内切酶Spe Ⅰ 酶切ES克隆的基因组DNA，酶切后的野生型等位基因长度为8.9kb，突变型等位基因长度为7.3kb。用3´侧翼探针进行 Southern杂交，筛选出198个独立的ES克隆。最终鉴定出5个同源重组克隆，并将其中2个克隆注射到囊胚中，产生嵌合体小鼠进行生殖系传递，产生F1杂合子小鼠，后续利用F1杂合小鼠交配，获得Necl4纯合敲除小鼠。

1.1 Necl4敲除小鼠快感降低

糖水偏好测试是一种基于奖励的测试，用作快感缺乏的指标。快感缺乏，或体验快乐的能力下降，是抑郁症的核心症状之一。啮齿类动物对甜食或甜味溶液有着与生俱来的兴趣。在糖水偏好测试中，用“糖水偏好指数”评价动物对甜溶液的偏好度，对甜溶液的偏好下降代表快感缺乏。

结果如图1所示，结果显示无论是分别统计雌鼠（图1A）和雄鼠（图1B），还是雌雄小鼠（图1C）一起统计，Necl4 WT小鼠糖水偏好指数都高于Necl4 KO小鼠，且两组间有显著性差异，说明Necl4的全身敲除可能会导致小鼠的抑郁情绪。
                                  

A：雌鼠糖水偏好率统计分析结果；B：雄鼠糖水偏好率统计分析结果；C：雌雄小鼠糖水偏好率统计分析结果（*：P﹤0.05；**：P﹤0.01）

1.2 Necl4敲除小鼠绝望情绪增强

强迫游泳实验通过将实验动物置于一个局限的环境中（例如水中），动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而营造出了一个无可回避的压迫环境，经一段时间的实验后，动物即表现出典型的“不动状态”，“不动状态”持续时间反映动物的绝望抑郁心理，“不动状态”持续时间越长代表动物绝望抑郁心理的增强。

本实验采用高25厘米，直径15厘米的玻璃烧杯，水深15厘米，水温23 ~ 25°C，玻璃杯前方为摄像头所在。实验开始时，将小鼠置于烧杯内，自由游泳6分钟。前2分钟为适应期，后4分钟为录像采集时间，由软件EthoVision XT 8完成。录像结束后，软件分析小鼠的不动时间并进行统计。小鼠完成测试后，从烧杯中取出小鼠，并用吸水纸轻柔擦拭体表流水，放入铺有干燥垫料的新饲养笼内。

实验结果如图2所示，Necl4 KO雌鼠（图2A）和雄鼠（图2B）在水中的不动时间均有显著性增加，雌雄小鼠同时统计的结果（图2C）与此一致，提示Necl4敲除可能导致小鼠的绝望情绪增强。

图2. 小鼠强迫游泳实验结果

A：雌鼠不动时间统计分析结果；B：雄鼠不动时间统计分析结果；C：雌雄小鼠不动时间统计分析结果（*：P﹤0.05；**：P﹤0.01；***：P﹤0.001）

1.3 Necl4敲除小鼠摄食兴趣降低

抑郁后的动物对食物的摄入兴趣降低、食欲下降。新环境会抑制小鼠进食，摄食实验是将饥饿处理1天后的小鼠放入新的环境中，观察小鼠克服对新环境的恐惧后首次摄取食物的潜伏期，可用来观察动物兴趣缺失的变化。首次摄食潜伏期的延长代表动物对摄食的兴趣降低。

结果如图3所示，分别统计雌鼠（图3A）与雄鼠（图3B）和同时统计雌雄小鼠（图3C）都显示Necl4 KO小鼠首次摄食的潜伏期比Necl4 WT小鼠长，且两组间有显著性差异，说明敲除Necl4可能会使小鼠对摄食的兴趣降低。

图3. 小鼠新环境抑制摄食实验结果

A：雌鼠摄食潜伏期统计分析结果；B：雄鼠摄食潜伏期统计分析结果；C：雌雄小鼠摄食潜伏期统计分析结果（*：P﹤0.05；**：P﹤0.01；***：P﹤0.001）

五羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素（NA）能够参与情绪调节，抑郁症患者体内5-HT和NA较低。本实验中将小鼠多个与抑郁症相关的脑区分离组织并提取匀浆液，分离的脑区包括丘脑（TH）、海马（HIP）、纹状体（STR）、前额叶皮层（PFC）、前扣带回额叶内侧（ACC）、小脑（CB）、嗅球（OLF）、延髓（MY）、脑桥（PO）和中脑（MB），共10个脑区。之后利用ELISA试剂盒检测溶液中5-HT(CUSABIO, CSB-E08365m)和NA(CUSABIO, CSB-E08365m)的浓度。实验结果如图4所示，5-HT在Necl4 KO小鼠的前额叶皮层（PFC）和中脑（MB）中显著下降（图4A），此外在其他多个脑区中也有一定的下降，推测Necl4 KO区均有明显变化。小鼠脑组织中多个脑区5-HT浓度下降，其下降可能导致小鼠的抑郁情绪增强。而NA在Necl4 WT和Necl4 KO小鼠的10个脑区中的浓度均无明显差异（图4B）。

图5.ELISA检测小鼠脑组织5-HT和NA的浓度

A：小鼠脑组织中5-HT的浓度统计分析结果；B：小鼠脑组织中NA的浓度统计分析结果（*：P﹤0.05）

突触连接是神经系统发挥功能的重要组成部分，为了检测Necl4对突触形态的影响，我们对皮层组织进行了超薄切片，并通过透射电镜进行观察。实验结果如图6所示，Necl4 KO小鼠皮层组织中不对称突触结构出现明显异常（5A），主要表现为与野生型相比，突触间隙均值明显增加（5B），累积分布曲线右移（5C），但PSD厚度无明显改变（5D），累积分布曲线也基本一致（5E）。

图6. 透射电镜观测小鼠皮层不对称突触超微结构

A：小鼠皮层组织不对称突触结构的透射电镜成像结果，白色短线长度表示为200nm；B&C：透射电镜成像结果中突触间隙宽度的分析结果，B为均值比较，C为累积分布曲线；D&E：透射电镜成像结果中突触PSD厚度的分析结果，D为均值比较，E为累积分布曲线（***：P<0.001，****：P<0.0001）

该模型通过Southern杂交和 PCR实验均证实了生殖细胞的传递。SpeⅠ酶切小鼠基因组DNA后用3´侧翼探针进行Southern杂交，野生型（WT）等位基因长度为8.9kb，突变型（KO）等位基因长度为7.3kb，如仅出现8.9kb条带则该小鼠为野生型，仅出现7.3kb条带则为突变型，出现两种条带则为杂合子（HE）。

PCR实验鉴定结果则是野生型（WT）会扩增出725bp的条带，突变型（KO）会扩增出268bp的条带，如两种条带都有则为杂合子（HE）。野生型鉴定引物为Forward primer- CGGAGCAGAGGGCGGGACTGGACT和Reverse primer- GGGACAAAGGCGGCGTGGAG

AAACG；突变型鉴定引物为Forward primer- TCAGCAGCCTCTGTTCCAC和Reverse primer- AATACGCACACCTCCCTCG。

Necl4敲除小鼠在糖水偏好测试中摄取蔗糖水减少，表现出快感缺乏；在强迫游泳实验中，Necl4敲除小鼠不动时间增加，表明其绝望情绪增强；在新环境抑制摄食实验中，Necl4缺失小鼠的摄食潜伏期显著延长，提示小鼠的兴趣降低。

5-HT在Necl4 KO小鼠的前额叶皮层（PFC）和中脑（MB）中显著下降，此外在其他多个脑区中也有一定的下降，推测Necl4 KO小鼠脑组织中多个脑区5-HT浓度下降，其下降可能导致小鼠的抑郁情绪增强。

4. 神经元突触形态观测

Necl4 KO小鼠皮层组织中不对称突触结构出现明显异常，与野生型相比，突触间隙均值明显增加，累积分布曲线右移。